Курсовая: Кровь

Курсовая: Кровь

Введение

Постоянно циркулируя в замкнутой системе кровообращения, кровь объединяет

работу всех систем организма и поддерживает многие физиологические показатели

внутренней среды организма на определенном, оптимальном для осуществления

обменных процессов уровне. На основе циркуляции форменных элементов и со

ставных веществ плазмы кровь выполняет в организме разносторонние жизненно

важные функции: дыхательную, трофическую, защитную, регуляторную,

выделительную и другие. Конкретное понимание многочисленных функций крови

возможно лишь на основе изучения строения и свойств ее основных компонентов —

форменных элементов и плазмы. (Александровская и др.,1987)

Снижение до минимума возможных ошибок и обеспечение высокого качества

гематологических исследований возможно при стандартизации преаналитического и

аналитического этапов работы. Изменения клеточного состава периферической

крови наблюдается как при патологии, так и в различных физиологических

состояниях организма. На показатели крови могут оказывать влияние физическая

и эмоциональная нагрузка, сезонные, климатические, метеорологические условия,

время суток, прием пищи, курение и т. д. Так при интерпретации результатов

необходимо учитывать такие данные, как возраст, пол, активность пациента и

положение его тела в момент взятие крови. (Луговская, 2001)

Цель курсовой работы это ознакомление и познание методов изучения клеточного

состава крови. Основные задачи это изучить методы исследования клеточного

состава крови: эритроцитов, лейкоцитов и кровяных телец, а также работа с

литературой касающейся непосредственно данной темы.

Глава 1.Клеточные компоненты крови

Внутрисосудистая кровь — подвижная тканевая система с жидким межклеточным

веществом — плазмой и форменными элементами — эритроцитами, лейкоцитами и

кровяными пластинками (тромбоцитами — у птиц и низших позвоночных).

Гистогенетически, структурно и функционально сосудистая кровь является частью

системы крови и тесно связана с органами кроветворения и кроверазрушения,

рыхлой соединительной тканью и другими тканями и органами. (Александровская и

др., 1987)

1.1 Эритроциты

Эритроциты — красные кровяные клетки. У человека это мелкие клетки, лишенные

ядра и имеющие форму двояковогнутых дисков. Средний диаметр эритроцитов

составляет 7—8 мкм и приблизительно равен диаметру кровеносных капилляров.

Специфическая форма эритроцита обусловливает более высокое отношение

поверхности к объему, что увеличивает возможности газообмена. Толщина

отдельного эритроцита очень мала, и это облегчает диффузию газов с

поверхности внутрь клетки. Благодаря эластичности своей мембраны эритроцит

может проходить через капилляры, просвет которых меньше его диаметра.

Процесс образования эритроцитов носит название гемопоэза (эритропоэза) или

кроветворение, а ткань, в которой он происходит, называют кроветворной или

гемопоэтической. У младенцев кроветворная ткань содержится во всех костях, а

у взрослых людей главными местами образования эритроцитов являются кости

черепа, рёбра, грудина, позвонки, ключицы и лопатки. В 1 мл крови содержится

около 5 млн. эритроцитов, но эта величина варьирует в зависимости от

возраста, пола и состояния здоровья.

Важнейшая особенность эритроцитов - присутствие в них гемоглобина, который

обратимо связывает кислород (превращаясь в оксигемоглобин) в участках с высокой

концентрацией 02 и отдает его в участках с низкой концентрацией 0

2. В эритроцитах содержится также фермент карбоангидраза, участвующий в

транспорте углекислоты.

Продолжительность жизни эритроцитов у взрослых людей оставляет около трех

месяцев, после чего они разрушаются в печени или селезенке. Белковые

компоненты эритроцита расщепляются на составляющие их аминокислоты, а железо,

входящее в состав гема, удерживается печенью и хранится в ней в составе

ферритина (белка, связывающего железо). Железо может в дальнейшем

использоваться повторно при образовании новых эритроцитов и при синтезе

цитохромов. Остальная часть молекулы гема расщепляется с образованием желчных

пигментов билирубина и биливердина. Оба пигмента в конце концов выводятся с

желчью в кишечник.

Каждую секунду в организме человека разрушается от 2 до 10 млн. эритроцитов.

Скорость распада эритроцитов и замещение их новыми зависит от содержания в

атмосфере кислорода, доступного для переноса кровью. Низкое содержание

кислорода в крови стимулирует костный мозг, и в нем образуется больше

эритроцитов, чем разрушается в печени. Этот механизм служит одним из путей

акклиматизации млекопитающих к пониженному содержанию кислорода в атмосфере

на больших высотах. При высоком содержании кислорода наблюдается

противоположная картина. (Грин и др., 1990)

1.2 Лейкоциты

Лейкоциты крупнее эритроцитов, но содержатся в крови в гораздо меньшем

количестве (около 7000 в 1 мл крови). Они играют важную роль в защите

организма против болезней. Все лейкоциты имеют ядро. Несмотря на наличие

ядра, продолжительность жизни лейкоцитов в кровяном русле составляет в норме

всего лишь несколько дней. Существуют две основные группы лейкоцитов —

гранулоциты (зернистые лейкоциты) и агранулоциты (незернистые лейкоциты).

Гранулоциты (зернистые, или полиморфноядерные, лейкоциты) образуются в

костном мозге, но не из тех клеток, из которых образуются эритроциты. Все

гранулоциты содержат разделенное на лопасти ядро и зернистую цитоплазму и

обладают способностью к амебоидному движению. Гранулоциты можно далее

подразделить на нейтрофилы, эозинофилы и базофилы.

Нейтрофилы (фагоциты) составляют 70% всех лейкоцитов. Они обладают

способностью проходить между клетками, образующими стенки капилляров, и

проникать в межклеточные пространства тканей (процесс, называемый диапедезом)

и направляться к инфицированным участкам тела. Нейтрофилы — активные

фагоциты, они поглощают и переваривают болезнетворные бактерии.

Эозинофилы содержат цитоплазматические гранулы, окрашиваемые эозином в

красный цвет. Обычно они составляют всего лишь 1,5% общего числа лейкоцитов,

но при аллергических состояниях (на пример, астме или сенной лихорадке) их

количество возрастает. Как полагают, эозинофилы обладают антигистаминным

действием. Содержание эозинофилов в крови контролируется гормонами коры

надпочечников. (Грин и др.,1990)

Базофилы - самая малочисленная разновидность гранулоцитов периферической

крови животных, составляют 0,5% популяции лейкоцитов. Они вырабатывают

фармакологически активные вещества - гепарин и гистамин; содержат гранулы,

которые окрашиваются в синий цвет основными красителями типа метиленового

синего. Базофилы участвуют в иммунологических реакциях организма, в частности

в реакциях аллергического типа. (Александровская,1987)

Агранулоциты (одноядерные лейкоциты) содержат ядро овальной формы и

незернистую цитоплазму. Существуют два основных типа агранулоцитов: моноциты

и лимфоциты.

Моноциты (4%) образуются в костном мозге и содержат ядро бобовидной формы.

Активно фагоцитируют (поглощают) бактерий и другие крупные частицы. Способны

мигрировать сквозь стенки капилляров в очаги воспаления, где действуют так

же, как нейтрофилы.

Лимфоциты (24%) образуются в тимусе (вилочковой железе) и лимфоидной ткани из

клеток предшественниц, поступающих из костного мозга. Имеют округлую форму и

содержат очень мало цитоплазмы. Способность к амебоидным движениям

ограниченна. Главная функция — индукция иммунных реакций или участие в них

(образование антител, отторжение трансплантата, уничтожение опухолевых

клеток). Продолжительность жизни варьирует от нескольких дней у грызунов до

десяти и более лет у человека. (Грин и др., 1990)

1.3 Кровяные пластинки

Кровяные пластинки представляют собой фрагменты клеток, имеющие неправильную

форму, окруженные мембранной и обычно лишенные ядра. Они образуются из

крупных клеток костного мозга, называемые мегакариоциты. Играют важную роль в

инициации свёртывания крови. В 1 мл крови содержится около 250

000тромбоцитов.

В сосудистой крови пластинки существуют около 9—10 суток, после чего

происходят их фагоцитоз, главным образом макрофагами селезенки.

Тромбоциты имеют важнейшее значение в обеспечении основных этапов Остановки

кровотечения — гемостаза. На месте повреждения эндотелия стенки сосуда и

обнажения базальной мембраны происходит оседание и агрегация пластинок. По

следующая их активация сопровождается изменением формы (пластинки становятся

шаровидными) и выделением ряда соединений, содержащихся в гранулах

(тромбоцитарные факторы), которые ускоряют агрегацию пластинок. Кровяные

пластинки крови кроликов выделяют значительное количество гистамина. В

результате агглютинации все новых и новых пластинок образуется сгусток (белый

тромб), препятствующий выхождению форменных элементов крови из поврежденного

сосуда. Вследствие изменения поверхности кровяных пластинок активируются

факторы свертывания, находящиеся в плазме крови, которые приводят к появлению

нерастворимого фибрина, заполняющего пространства между коагулированными

пластинками. В последующей ретракции кровяного сгустка имеет значение

содержащийся в пластинках тромбостенин (сократительный белок).

(Александровская, 1987)

Глава 2. Методы исследования клеточного состава крови.

2.1 Метод подсчета количества эритроцитов.

Наиболее распространен классический микроскопический метод подсчета клеток в

камере Горяева.

Принцип: Подсчет эритроцитов под микроскопом в определенном количестве

квадратов счетной сетки с последующим пересчетом на 1 мкл крови, исходя из

объёма квадратов и разведения крови.

Ход определения: Исследуемую кровь разводят в 200 раз, для чего в пробирку с

4 мл 0,9% раствор хлорида натрия добавляют 20 мкл крови. Кончик пипетки

вытирают фильтровальной бумагой или марлей, и кровь выдувают на дно пробирки.

Пипетку тщательно промывают в верхнем слое жидкости, содержимое пробирки

перемешивают и оставляют стоять до момента подсчета. К счетной камере

притирают шлифовонное стекло и заполняют ее разведенной кровью.

Предварительно несколько раз тщательно встряхивают содержимое пробирки, затем

стеклянной или пластиковой пастеровской пипеткой (Deltalab) или стеклянной

палочкой отбирают каплю разведенной крови и подносят ее к краю покровного

стекла, следя за тем, чтобы она равномерно без пузырьков воздуха заполнила

всю поверхность камеры с сеткой, не затекая в бороздки. Заполненную камеру

оставляют в горизонтальном положении на 1 мин (для оседания эритроцитов).

Подсчет эритроцитов производят в 5 больших квадратах, разделенных на 16

малых, т.е. в 80 малых квадратах. Рекомендуется считать клетки в квадратах

сетки, расположенных по диагонали. Для того чтобы не считать одни и те же

эритроциты, лежащие на линиях, принято считать клетки только на определенных

двух линиях (например, на левой и верхней).

Расчет количества эритроцитов в 1 мкл крови производят, исходя из разведения

крови (200), числа сосчитанных квадратов (80) и объема 1 малого квадрата

(1/4000 мкл), по формуле:

где Х - число эритроцитов в 1 мкл крови; а - число сосчитанных эритроцитов.

Эритроциты рекомендуется считать в течение 2-З часов после взятия крови. При

гемолитических и мегалобластных анемиях - сразу после взятия, так как

эритроциты легко разрушаются.

Ручные методы подсчета клеток чрезвычайно трудоемки и не всегда дают

достаточно точные результаты, так как при визуальном подсчете постоянно

присутствует субъективный фактор. Кроме того, малейшие отклонения от правил

подготовки камеры и подсчета клеток влияют на конечный результат

исследования. Вместе с тем, эти методы не требуют сложного оборудования,

реактивов и могут быть применены практически в любых условиях.

Основными источниками ошибок при подсчете эритроцитов являются:

•Неточное взятие крови в пипетку.

•Образование сгустка, поглощающего часть клеток и занижающего результат

исследования.

•Недостаточное перемешивание содержимого пробирки перед заполнением камеры.

•Неправильная подготовка камеры: недостаточное притирание покровных стекол;

неравномерное заполнение камеры, образование пузырьков воздуха.

•Подсчет эритроцитов сразу после заполнения камеры, не выжидая 1 минуту.

•Подсчет меньшего, чем требуется по методике, количества квадратов.

•Плохо вымытые камера, пробирки, пипетка, капилляр для взятия крови;

недостаточно просушенные пробирки и пипетки.

• Использование недоброкачественного разводящего раствора. (Луговская и др.,

2001)

2.2 Метод подсчета количества лейкоцитов.

Определение количества лейкоцитов в счетной камере: Подсчет лейкоцитов под

микроскопом проводят после лизирования эритроцитов в 100 больших квадратах

счетной сетки и пересчитывают на 1 л крови, исходя из объема квадратов и

разведения крови. Подсчет лейкоцитов должен быть произведен в течение 2-4 ч

после взятия крови.

Реактивы: 3-5% раствор уксусной кислоты, подкрашенный несколькими каплями

раствора метиленового синего (для окраски ядер лейкоцитов). Раствор голубого

цвета, длительно годен к употреблению.

Ход определения: В пробирку с 0,4 мл уксусной кислоты набирают из пальца 20

мкл крови (разведение 1:20). Можно использовать стабилизированную

антикоагулянтом венозную кровь. Выдувают кровь из пипетки на дно пробирки,

затем тщательно перемешивают, повторно ее набирая и выдувая. Заполненную

камеру оставляют в горизонтальном положении на 1 мин (для оседания

лейкоцитов). Лейкоциты подсчитывают в 100 больших квадратах с малым

увеличением (окуляр 10х, объектив 8х). Для большей точности счет лейкоцитов

проводят по всей сетке в больших квадратах (неразделенных на малые квадраты и

полосы), начиная с левого верхнего угла сетки. Для лучшего контрастирования

затемняют поле зрения, опуская конденсор и закрывая диафрагму.

Расчет числа лейкоцитов проводят по формуле:

где Х — число лейкоцитов в 1 мкл крови, а - число лейкоцитов в 100 больших

квадратах, 20 — разведение крови, 100- число подсчитанных квадратов, 250

—объем одного большого квадрата 1/250.

Таким образом, количество лейкоцитов, подсчитанных в 100 больших квадратах,

умножают на 50.

При наличии в периферической крови ядросодержащих клеток красного ряд, они не

лизируются и подсчитываются вместе с лейкоцитами. В этом случае, чтобы

определить истинное количество лейкоцитов, из общего числа посчитанных клеток

вычитают количество клеток красного ряда.

Например: Общее количество лейкоцитов при подсчете в камере (или на анализаторе)

– 45*109/л. При подсчете лейкоцитарной формулы найдено, что на 100

лейкоцитов присутствует 50 эритробластов (нормобластов).

Рассчитываем истинное количество лейкоцитов в крови:

150 клеток (общее количество - 45*109/л (количество

клеток в 1 мкл, лейкоцитов и нормобластов, полученное при

подсчете в камере полученное при подсчете или на

анализаторе)

лейкоцитарной формулы)

100 клеток (лейкоциты) - Х (истинный лейкоцитоз крови)

Таким образом, истинное число лейкоцитов в крови составляет 30 * 109/л.

Основные источники ошибок при подсчете лейкоцитов в камере:

• Неправильное соотношение объемов крови и уксусной кислоты, взятые в пробирку.

• Неправильно подготовленный раствор уксусной кислоты (при концентрации

большей, чем 5%, часть лейкоцитов может лизироваться, что приведет к

занижению результата).

•Длительное нахождение пробы при температуре выше 28°С, что может ускорить лизис

лейкоцитов в образце и привести к занижению результата.

•Неправильное заполнение камеры Горяева. Как и при подсчете эритроцитов,

камеру необходимо оставлять на 1 минуту для оседания клеток.

•Недостаточно хорошо отмытая после предыдущего определения камера Горяева.

Оставшиеся в камере лейкоциты могут завышать результаты анализа. (Луговская и

др., 2002)

2.3 Методы подсчета количества тромбоцитов.

Для определения количества тромбоцитов используют следующие методы: подсчет в

счет ной камере, мазках крови и гематологическом анализаторе. Каждая группа

методов имеет преимущества и недостатки.

Подсчет тромбоцитов в камере достаточно точен, не требует для расчета

количества эритроцитов. С другой стороны этот метод более трудоемкий,

поскольку тромбоциты в нативном виде представлены мелкими и плохо

контрастированными элементами. Недостаток метода в необходимости подсчета

тромбоцитов в ближайшие часы после взятия крови.

Определение количества тромбоцитов в мазках крови значительно уступает по

своей точности камерному методу или автоматическим счетчикам. Ошибки при

подсчете в мазках крови могут быть обусловлены плохим качеством мазка и

связанным с этим неравномерным распределением тромбоцитов, неточным

определением количества эритроцитов крови. Существенное неудобство метода -

необходимость одновременного подсчета тромбоцитов и эритроцитов в крови.

Преимущество его - возможность исследования тромбоцитов в любое время,

независимо от момента взятия крови.

Метод определения тромбоцитов с помощью гематологического анализатора

позволяет достаточно точно определить количество тромбоцитов, их средний

объем и распределение по объему. (Луговская и др., 2002)

Метод подсчета в камере.

Принцип: Определение количества тромбоцитов в 1 л крови с учетом ее

разведения и объема квадрата счетной сетки камеры Горяева с применением

фазово-контрастного устройства для контрастирования тромбоцитов.

Реактивы: Применяют 1% раствор оксалата аммония, который быстро и полностью

лизирует эритроциты. Раствор кипятят и фильтруют. Хранят в холодильнике.

Ход определения: Исследуемую кровь разводят в 200 раз; для этого в сухую

пробирку набирают 4 мл реактива и 0,02 мл крови. Перемешивают и оставляют на

25-ЗО мин для гемолиза эритроцитов. Подготавливают счетную камеру.

Перемешивают разведенную кровь и заполняют камеру: подносят каплю крови с

помощью стеклянной палочки или пастеровской пипетки к краю покровного стекла,

следя за тем, чтобы кровь равномерно без пузырьков воздуха заполняла всю

поверхность сетки, не затекая в бороздки. Помещают счетную камеру во влажную

камеру на 5 мин для оседания тромбоцитов (чашка Петри с уложенной по краям

смоченной водой фильтровальной бумагой). Подготавливают фазово-контрастное

устройство в соответствии с инструкцией, приложенной к нему. Тромбоциты

считают в 25 больших квадратах.

Тромбоциты выглядят в счетной камере в виде мелких, хорошо преломляющих свет

образований.

Расчет тромбоцитов проводят по формуле:

,

где Х - число тромбоцитов в 1 мкл крови; а - число тромбоцитов, сосчитанных в

25 больших квадратах, 200 - разведение крови, 25 - число сосчитанных

квадратов, 250 - объем одного большого квадрата 1/250 мкл. Число подсчитанных

тромбоцитов умножают на 2000.

Воспроизводимость. Ошибка метода составляет 6,5%. (Клиническая лабораторная

аналитика, 1999)

Метод подсчета в мазках крови (по Фонио).

Принцип: Метод основан на подсчете числа тромбоцитов в окрашенных мазках

крови на 1000 эритроцитов с расчетом на 1 мкл (или 1 л) крови, исходя из

содержания в этом объеме количества эритроцитов.

Реактивы: Применяют 14% раствор сульфата магния или 6% раствор

этилендиаминтетраацетата натрия (ЭДТА).

Ход определения: Реактив набирают в капилляр Панченкова до метки “75 и вносят

в пробирку, затем добавляют кровь, взятую тем же капилляром, до метки “0”.

Содержимое пробирки перемешивают и готовят тонкие мазки. Фиксируют и

окрашивают по Романовскому-Гимзе в течение 2-3 ч (при использовании раствора

сульфата магния) и в течение 30-45 мин (при приме нении ЭДТА). Высохшие мазки

микроскопируют с иммерсионным объективом, подсчитывая количество тромбоцитов

в тонких местах препарата (эритроциты должны быть расположены разрозненно).

Подсчет проводят следующим образом: в каждом поле зрения микроскопа считают

число эритроцитов и тромбоцитов, передвигая мазок до тех пор, пока не будут

просчитаны 1000 эритроцитов.

Расчет: количество тромбоцитов на 1000 эритроцитов составляет А‰ Зная число

эритроцитов в 1 л крови, подсчитывают количество тромбоцитов в 1 л крови.

Например: А=60‰; число эритроцитов 5 *1012/л

Составляют пропорцию: 60 - 1000

Х - 5*1012/л, откуда

Нормальные величины тромбоцитов 180,0-320,0 * 109/л

В настоящее время существуют готовые наборы для подсчета тромбоцитов (фирма

«Гем»). (Луговская и др., 2002)

Заключение.

Для подсчета и анализа клеток крови используют ручные микроскопические методы

и гематологические счетчики разного уровня автоматизации. В настоящее время

необходимо внедрение технологий автоматического изучения клеточного состава

крови, для того чтобы добиться высокого качества и точности исследований,

исключая ошибки, зависящие от работы лаборантов. Клинические лаборатории

нуждаются в разработке новых более совершенных методов.

За последние 15 лет произошло существенное развитие технологий и аппаратуры

для автоматического исследования клеток. В некоторых странах мира

автоматический анализ крови почти полностью заменил ручные и

полуавтоматические. (Луговская и др., 2002)

Список литературы.

1. Александровская О.В., Радостина Т.Н., Козлов

Н.А. Цитология, гистология и эмбриология. – М: Агропромиздат, 1987 – 448 с.

2. Грин Н. , Стаут У., Тейлор Д. Биология. – М:

Мир, 1990. – Т. 3, №2. – С. 193 с.

3. Клиническая лабораторная аналитика //под ред.

Меньшикова В.В. – М: 1999. – т 2.

4. Луговская С.А., Морозова В.Т., Почтарь М.Е.,

Долглов В.В. Лабораторная гематология. – М: Юнимед-пресс, 2002. – 115 с.

5. Луговская С.А. Лабораторная гематология. – М:

Лаборатория, 2001 - №2 2-3 с.