 |
РУБРИКИ |
Реферат: Проблемы экстракорпорального оплодотворения |
РЕКОМЕНДУЕМ |
||
|
Реферат: Проблемы экстракорпорального оплодотворенияРеферат: Проблемы экстракорпорального оплодотворенияОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ........................... 2 ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОЕ ОПЛОДОТВОРЕНИЕ. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ..................... 4 Показания к ЭКО........................ 5 ЭМБРИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРОГРАММЫ ЭКО И ПЭ....... 7 Культуральные среды.................... 7 CO2-инкубатор......................... 8 Идентификация и оценка качества ооцитов...........9 Обработка спермы перед оплодотворением ооцитов in vitro.... 11 Оплодотворение ооцитов in vitro................ 12 Оплодотворение – теоретические аспекты............. 13 Оценка качества эмбрионов................... 16 Стратегия переноса эмбрионов................ 17 Техника переноса эмбрионов...................18 СТИМУЛЯЦИЯ СУПЕРОВУЛЯЦИИ В ПРОГРАММЕ ЭКО И ПЭ...... 19 ОСНОВНЫЕ ПРОБЛЕМЫ, ВОЗНИКАЮЩИЕ ПРИ ПРИМЕНЕНИИ ЭКО И ПЭ...................... 21 ЗАКЛЮЧЕНИЕ........................... 24 ЛИТЕРАТУРА............................ 25 ВВЕДЕНИЕ Среди методов лечения бесплодия можно условно выделить те, что направлены на восстановление естественной фертильности супружеской пары и те, что используют технику искусственного оплодотворения. К первым относятся попытки лечения хронического воспалительного процесса в малом тазу, хирургического и нехирургического восстановления проходимости маточных труб, коррекция эндокринных расстройств и нарушенного сперматогенеза. Ко вторым – внутриматочная инсеминация спермой мужа или донора, экстракорпоральное оплодотворение с последующим переносом эмбрионов в матку матери в различных его вариантах. До недавнего времени лечение трубного бесплодия исчерпывалось бесконечным повторением трудоемких для врача и утомительных для больных физиотерапевтических процедур и курсов гидротубаций в сочетании с противовоспалительной терапией. Эффективность данного вида лечения в отношении восстановления проходимости труб чрезвычайно низка, а последствия в виде перерастяжения ампулярных отделов труб и потери их функциональной способности достаточно серьезны, поскольку предопределяют бесперспективность последующего хирургического лечения. Последнее также не оправдало ожиданий, возлагаемых на него специалистами. Так было показано, что при непроходимости ампулярных отделов маточных труб, вызванной "внешними" факторами (спайками, например), частота наступления беременности после реконструктивно-пластических операций довольно велика и составляет 20 - 70% (в зависимости от квалификации хирурга и степени выраженности спаечного процесса). При непроходимости же маточных труб в истмических отделах, связанной с внутренним адгезивным слипчивым процессом, частота наступления беременности даже после микрохирургических операций составляет всего 0 - 5%. В то же время эти операции, выполняемые путем чревосечения, достаточно травматичны и сопряжены с определенным риском для больной. Поэтому, в последние годы наблюдается тенденция к замене больших полостных операций на малые, "лапароскопические", т.е. выполняемые во время оперативной лапароскопии. Наиболее распространенными операциями, выполняемыми во время лапароскопии, на сегодняшний день являются: рассечение спаек с целью восстановления проходимости маточных труб, удаление небольших кист яичников и миоматозных узлов, прижигание очагов эндометриоза, коагуляция поликистозных яичников и даже удаление маточной трубы при внематочной беременности. Основным преимуществом оперативной лапароскопии перед большими полостными операциями является значительно меньший риск как в отношении здоровья больной, так и в отношении рецидива спаечного процесса, а также быстрота возвращения больной к активной жизни. Однако возможности оперативной лапароскопии ограничены. Выполнение больших реконструктивных операций возможно только во время чревосечения. Эффективность лечения бесплодия после таких операций весьма невелика. Женщинам с сопутствующими эндокринными нарушениями, которым предстоит лечение бесплодия путем пластической операции на маточных трубах, необходима предварительная гормональная коррекция, поскольку эффект подобной операции и последующего восстановительного лечения нестойкий, связан с риском повторного воспаления и рецидива непроходимости труб. В этой ситуации терять время на нормализацию гормональных нарушений после операции нецелесообразно. Несколько слов следует сказать о противовоспалительном лечении. Как правило, трубно-перитонеальное бесплодие является следствием хронического воспалительного процесса в малом тазу, возникшего в результате банальной или специфической (гонорея, хламидиоз) инфекции, нередко как осложнение аборта. Однако противовоспалительное лечение не есть лечение бесплодия, но оно необходимо во всех случаях, когда женщине предстоят внутриматочные вмешательства, лечебные или диагностические: снимок матки и труб, лапароскопия с введением в матку красящего вещества, внутриматочная инсеминация, ЭКО и т.д. Во всех случаях предварительное противовоспалительное лечение позволяет избежать обострения воспалительного процесса и убрать факторы, снижающие вероятность наступления беременности и выкидыша в том случае, когда она наступила. Недостаточная эффективность методов, направленных на восстановление естественной фертильности человека в случаях трубного и трубно- перитонеального бесплодия, стимулировала развитие методов искусственного оплодотворения. Последние годы отмечены стремительным ростом как числа самих методов искусственного оплодотворения, так и объема их применения. Остановимся вкратце на возможностях и эффективности каждого из этих методов, а также на показаниях к их использованию. Внутриматочная инсеминация (ИСМ) производится в тех случаях, когда женщина полностью здорова и трубы проходимы, а у мужа имеется снижение оплодотворяющей способности спермы, однако показатели ее таковы, что после некоторых манипуляций она становится достаточной, чтобы оплодотворить яйцеклетку после введения непосредственно в матку. Кроме того, попытка ИСМ производится и при нормальных показателях спермы, если установлена несовместимость супружеской пары, связанная с отрицательным действием на сперматозоиды шеечной слизи. При этом делается расчет на то, что при ИСМ обходится "убийственный" для спермы фактор - шеечная слизь, так как сперматозоиды вводят прямо в полость матки. В тех случаях, когда сперма мужа совсем плоха или барьер несовместимости одолеть не удается, с согласия обоих супругов прибегают к оплодотворению спермой донора - ИСД. Техника ИСМ и ИСД одинакова. В благоприятный для беременности день цикла, устанавливаемый по данным УЗИ, РТ, характеру шеечной слизи, в матку женщины вводят предварительно обработанную сперму. Иногда попытку производят 2 - 3 раза в течение цикла. Эффективность этой процедуры достаточно велика: при ИСМ она достигает 20 - 40%, при ИСД: 50 - 80% (максимальное число циклов, в которых целесообразно предпринимать попытки, - 4). Другой разновидностью искусственного оплодотворения является ГИФТ - перенос яйцеклеток вместе со сперматозоидами в маточные трубы. Суть его в следующем: у женщины берут одну или несколько яйцеклеток, у мужа сперму, смешивают их и вводят в маточную трубу. Условием успеха этой процедуры является своевременность ее проведения, проходимость и полноценность маточных труб. То есть показания те же, что и при мужском бесплодии или несовместимости супругов. Иногда прибегают к другому варианту искусственного оплодотворения - переносу эмбриона (зиготы) в маточную трубу, так называемую ЗИФТ. Считается, что при ЗИФТе вероятность наступления беременности существенно выше. ГИФТ и ЗИФТ могут быть выполнены как во время лапароскопии, так и под ультразвуковым контролем. В первом случае гаметы или зиготы вводят в трубу со стороны брюшной полости, во втором - через шейку матки. Как правило, ГИФТ и ЗИФТ совмещают с диагностической лапароскопией у женщин с неясной формой бесплодия и проводят однократно. Врачи, практикующие эти виды лечения бесплодия, отмечают их высокую эффективность - до 30%. Однако в нашей стране ГИФТ и ЗИФТ практически не применяются. Абсолютное женское бесплодие - отсутствие или стойкая непроходимость маточных труб являются показанием к экстракорпоральному оплодотворению с последующим переносом эмбрионов в матку матери (ЭКО). ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОЕ ОПЛОДОТВОРЕНИЕ. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ. ЭКО - истинная сенсация XX века в социальном, биологическом, религиозном и моральном плане. Успешно начатая программа до настоящего времени активно обсуждается с различных позиции. Большинство ученых рассматривают ее как блестящую возможность изучения процесса оплодотворения у человека с помощью современных методов исследования для создания фундаментальной теории этого удивительного и неожиданно широко распространившегося клинического эксперимента. Исторически новое направление в лечении бесплодия – экстракорпоральное оплодотворение яйцеклетки (ЭКО) возникло в 1978 г. в Англии. Вначале метод ЭКО и ПЭ применялся преимущественно в случаях бесплодия, обусловленного непроходимостью или отсутствием у женщин маточных труб. В таких случаях метод предусматривает получение яйцеклеток из яичника женщины, оплодотворение их in vitro и перенос эмбриона в полость матки после нескольких его дроблений in vitro. Метод был разработан Р. Эдвардсом и П. Стептоу (Англия) и назван In vitro fertilization and embryo transfer (IVF&ET). В русскоязычном варианте название метода звучит следующим образом: экстракорпоральное оплодотворение и перенос эмбрионов в полость матки (ЭКО и ПЭ). В России этот метод впервые был внедрен в 1985 г. в НИИ акушерства и гинекологии МЗ СССР под руководством Б. В. Леонова и В. И. Кулакова. Рождение первого ребенка произошло в 1986 г. в Центре охраны здоровья матери и ребенка МЗ СССР. Программа ЭКО, конечно, имеет длительную предысторию. Немецкий ученый К. Semn (1982) считает началом этой программы открытие Г. Фолом в 1877 г. феномена пенетрации мужской гаметы и яйцеклетку с последующим оплодотворением. Однако вряд ли подобное открытие было бы возможно, если бы три столетия раньше Левенгук не открыл существования живых клеток. Вместе с тем открытие Г. Фола стимулировало первую попытку экстракорпорального оплодотворения яйцеклеток крольчих и морских свинок S. L. Schenk (1878). Попытки экстракорпорального оплодотворения яйцеклетки человека начались с 1944 г. J. Rock, M. Melkin культивировали ооцит человека и произвели ЭКО, приведшее к развитию двухклеточного эмбриона. В наше время этот метод получил настолько широкое распространение, что давно уже перестали подсчитывать число детей, родившихся после ЭКО. Бурный прогресс метода обусловлен успехами фармакологии и эхоскопии, биохимии. Синтезированы агонисты рилизинг гормонов в 50-100 раз более активные, чем эндогенные люлиберины, получены высокоочищенные гонадотропные препараты, в том числе и обладающие изолированным ФСГ действием. Это позволило стимулировать в яичнике суперовуляцию – развитие сразу нескольких фолликулов, содержащих яйцеклетку. Внедрены в практику эхоскопические приборы с высокой разрешающей способностью и оснащенные влагалищными датчиками и инструменты для забора яйцеклетки через свод влагалища под ультразвуковым контролем. Все это облегчило проведение метода и привело к его распространению. Во многих странах Европы и Америки ЭКО относят к рутинным методам лечения бесплодия. Бурное обсуждение моральных, этических и юридических аспектов ЭКО отошло в прошлое. Допустимо и практикуется оплодотворение спермой донора, имплантация «чужого» эмбриона, расширены возрастные границы ЭКО. Опубликованы случаи рождения детей после ЭКО у женщин в возрасте старше 50 лет. ЭКО и ПЭ достаточно сложны и требуют дорогостоящих оборудования, реактивов, препаратов и, главное, - специальных знаний. Все это привело к тому, что ЭКО и ТЭ являются обособленной областью гинекологической практики и выполняются только специалистами. Для практического гинеколога необходимы знания: • о показаниях к ЭКО, • о методах стимуляции суперовуляции, • о лечении возможных ее осложнений.
Рис.1. Схема лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения: 1 - яичник со множеством фолликулов - результат воздействия препаратов; 2 - пункция яичников, получение яйцеклеток (в строго определенный момент); 3 - соединение яйцеклеток со специально подготовленными сперматозоидами; 4 - культивирование в специальных условиях в течение 24 - 62 ч; 5 - образовавшийся 4-клеточный эмбрион; 6 - перенос эмбрионов в полость матки. Как видно из рис.1 метод состоит из следующих этапов: 1. Уточнение характера и причин бесплодия; 2. Назначение препаратов, стимулирующих рост нескольких фолликулов - индукция суперовуляции; 3. Оценка ответа яичников на применение указанных препаратов при помощи серии ультразвуковых и гормональных исследований - гормональный и ультразвуковой мониторинг. 4. Определение момента, когда следует произвести пункцию фолликулов (как можно ближе ко времени естественной овуляции), что делается при помощи ультразвуковых исследований и определения концентрации гормонов в сыворотке крови или моче; 5. Пункция фолликулов, аспирация (отсасывание) их содержимого, извлечение из него яйцеклеток, помещение их в специальную питательную среду и условия; 6. Получение и подготовка сперматозоидов; 7. Соединение яйцеклеток и сперматозоидов (инсеминация яйцеклеток) в "пробирке" и помещение их в инкубатор на 24 - 42 часа; 8. Перенос эмбрионов в матку матери; 9. Назначение препаратов, поддерживающих имплантацию и развитие эмбрионов; 10. Диагностика беременности; 11. Ведение беременности и родов. Таким образом, ЭКО представляет собой сложный многоступенчатый процесс. Он требует назначения различных препаратов и многократной оценки состояния женщины в течение цикла, в котором производится попытка ЭКО. Успех ЭКО зависит от многих обстоятельств: реакции яичников женщины на примененные препараты - чем больше получено яйцеклеток, тем выше шанс беременности; своевременности получения зрелых, способных к оплодотворению яйцеклеток: техники выполнения пункции и переноса эмбрионов; качества спермы; условий культивирования гамет и эмбрионов и многих других факторов, включая психологический настрой бесплодной супружеской пары.
ПОКАЗАНИЯ К ЭКОВажный научно-практичесикий аспект программы ЭКО и ПЭ представляет изучение патогенеза бесплодия. Абсолютными показаниями являются трубное бесплодие вследствие непроходимости или отсутствия маточных труб. Относительные показания: § предшествовавшие оперативные вмешательства (пластические операции) на маточных трубах у женщины в возрасте старше 30 лет, если после операции прошло более года; § некоторые формы эндометриоза; § бесплодие неясного генеза; § иммунологическое бесплодие при постоянно высоком уровне антиспермальных антител. Существуют генетические критерии отбора для ЭКО. Метод не рекомендуется при гипоспадии, врожденных пороках сердца, шизофрении, аффективном психозе, при наличии в семье детей с аутосомно-рецессивными заболеваниями, риск повторного наследования которых достигает 25 %. Противопоказаниями являются доминантно наследуемые болезни. Большое внимание уделяется дальнейшему изучению патогенеза, профилактике и лечению синдрома гиперстимуляции яичников (СГЯ), представляющего собой серьезное осложнение, возникающее при проведении стимуляции суперовуляции. Важное значение в реализации программы ЭКО и ПЭ имеют исследования роли эндокринных нарушений, их профилактика и коррекция. В предварительном обследовании потенциальных пациентов программы ЭКО и ПЭ необходимо уделять большое внимание исследованию содержимого цервикального канала у женщины в целях диагностики инфекций, относящихся к так называемой группе TORCH-комплекса (трихомонады, краснуха, хламидии и др.). Должна осуществляться не только их диагностика, но и лечение. Лишь пациенты, прошедшие соответствующую коррекцию, могут быть включены в программу ЭКО и ПЭ. Необходима также тщательная кольпоскопия для исключения новообразований шейки матки. За 2 – 3 мес. до ЭКО и ТЭ следует произвести тщательное обследование спермы, бактериологическое исследование и посев. Бесплодие у мужчин связано, как правило, с перенесенными ими неспецифическими инфекционными заболеваниями (краснуха, корь), а также с неправильным лечением ряда заболеваний, передаваемых половым путем, а также венерических (например, гонорея). Причиной бесплодия может быть крипторхизм. Ряд вредных действий внешней среды, как бытового, так и промышленного происхождения, может являться причиной нарушения сперматогенеза. ЭМБРИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРОГРАММЫ ЭКО И ПЭ Эмбриологический этап программы ЭКО и ПЭ является одним из важнейших, поскольку оценка качества ооцитов, их оплодотворение и культивирование in vitro до стадии преимплантационных эмбрионов во многом определяют ее успех. Ключевым моментом этого этапа программы является подбор адекватных культуральных сред и условий культивирования, приближающихся к естественной среде для преимплантационного развития. КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СРЕДЫ Культуральная среда для ЭКО должна быть максимально приближена по всем параметрам к естественным жидкостям, в которых ооциты и эмбрионы человека находятся in vivo, т. е. маточных труб и матки. После овуляции яйцеклетка попадает в маточную трубу (ампулярный отдел), где и происходит оплодотворение. Затем зигота и впоследствии эмбрион передвигается по трубе в течение 4 - 5 дней, попадая в полость матки на стадии морулы. Практика показала, что многие среды, различающиеся по составу, могут успешно имитировать естественную среду для ооцитов и эмбрионов человека. Однако существует несколько основных характеристик, которым должны отвечать культуральные среды. Уровень рН Уровень рН среды обычно должен равняться 7,4, что соответствует рН крови. Экспериментально было показано, что такая кислотность оптимальна для оплодотворения и преимплантационного развития эмбрионов человека. В качестве буферной системы обычно используется бикарбонатный буфер в присутствии 5% CO 2 в атмосфере. Этот буфер был выбран главным образом потому, что он соответствует физиологической буферной системе крови, а парциальное давление CO2 в легких составляет 40 мм рт. ст., что соответствует 5%. Для индикации уровня рН во многих средах используется цветной индикатор – феноловый красный, меняющий окраску с фиолетовой (через красную и оранжевую) на желтую при закислении среды – изменении рН с 8,0 до 6,5. При рН 7,4 среда с таким индикатором приобретает характерный красно-оранжевый цвет.
ОсмолярностьВажной характеристикой среды является ее осмолярность, определяемая концентрацией и константами диссоциации ее компонентов. Обычно осмолярность равняется 285 мОсм/кг воды и соответствует таковой крови. Ооциты и эмбрионы млекопитающих обычно культивируются в открытых системах с максимально достижимой влажностью (80 - 90% в зависимости от модели CO2 -инкубатора), что предотвращает сильные колебания осмолярности в процессе культивирования.
Качество водыОсновой любой культуральной среды является вода, качество которой во многом определяет успех культивирования. Для питательных сред используется вода, полученная после двойной дистилляции, ультрафильтрации либо деионизации. При этом необходимо соблюдение полной стерильности в процессе ее приготовления и хранения. Эндотоксины, выделяемые бактериями, оставшимися в среде после ее ультрафильтрации, могут оказать токсическое воздействие на эмбрионы.To же может произойти и при попадании бактерий в среду в процессе хранения.
Ионный составИонный состав культуральных сред может сильно варьировать. Первые среды для культивирования ооцитов и эмбрионов млекопитающих представляли собой модификацию раствора Кребса. Они содержали ионы, необходимые для поддержания жизни клеток – Na+, К+, Са2+, Mg2+, и бикарбонатном буфере (НCO3). Также добавлялись антибиотики для предотвращения бактериального заражения и источник белка в форме альбумина или сыворотки. Наиболее часто в качестве источника белка используется бычий или человеческий сывороточный альбумин, а также инактивированная человеческая сыворотка. Примерами таких сред могут служить Ml6, Т6, HTF (человеческая трубная жидкость), EBSS (сбалансированный солевой раствор Эрла) и др. Более сложные по составу среды, такие, как Ham's F10 и F12, aМЕМ, М199, хотя и были разработаны для тканевых культур, но могут использоваться и для культивирования эмбрионов различных видов млекопитающих. Энергетическими субстратами для ооцитов и эмбрионов млекопитающих в культуральной среде обычно служат пируват, лактат и глюкоза, причем усвоение глюкозы эмбрионы человека начинают лишь до прошествии нескольких клеточных делений, а до этого предпочтительным источником энергии служит пируват. Добавление аминокислот во многие культуральные среды объясняется их присутствием в жидкости яйцеводов многих видов млекопитающих. Было показано, что добавление глутамина в культуральную среду оказывает положительное влияние на развитие эмбрионов многих видов млекопитающих. Однако при введении в среду аминокислот надо иметь в виду, что не все они остаются стабильны в условиях культивирования – при температуре 37С многие из них разрушаются, образуя аммоний, который при накоплении в среде обладает токсическим эффектом. Специально для культивирования эмбрионов Menezo с соавт. была разработана среда В2, гораздо более сложная по составу: помимо солей, она содержит аминокислоты, витамины, нуклеотиды, микроэлементы и - в ряде случаев – даже жирные кислоты. Все эти среды применяются в практике ЭКО в различных лабораториях. При том, что роль многих компонентов сложных сред до сих пор не была убедительно показана, их применение дает хорошие результаты. CO2-ИНКУБАТОР Культивирование ооцитов и эмбрионов человека проводится в присутствии 5% CO 3 в воздухе при температуре 37±0,1 °С и влажности 80 – 90%. Эти условия соблюдаются при использовании CO3-инкубаторов, поддерживающих необходимую температуру, влажность и уровень CO2 в камере. Последний параметр поддерживается посредством подачи углекислого газа из баллона, где он находится в сжиженном состоянии, и воздуха из окружающей среды. Углекислый газ для культивирования должен соответствовать медицинским стандартам по чистоте. В некоторых клиниках применяется готовая газовая смесь, содержащая углекислый газ, азот и кислород в нужной пропорции. Влажность в камере CO3-инкубаторов поддерживается постоянным испарением воды со дна камеры либо из специального лотка. Также в некоторых современных инкубаторах имеется система инжекции воды в циркулирующий воздух, позволяющая автоматически поддерживать влажность в камере до 90%. В связи с высоким уровнем влажности в инкубаторах высок риск роста бактерий и плесени, поэтому необходима регулярная очистка всех поверхностей камеры. Как правило, для этой цели используют 70% этиловый спирт, однако делать это надо с большой осторожностью, поскольку известно негативное влияние этилового спирта на ооциты и ранние эмбрионы. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ООЦИТОВ Во время трансвагинальной пункции (ТВП) преовуляторных фолликулов вместе с фолликулярной жидкостью в пробирки попадают комплексы ооцит-cumulus. Cumulus oophorus (яйценосный бугорок) представляет собой часть фолликулярного эпителия, непосредственно контактирующую с ооцитом в процессе фолликулогенеза. Помимо прочего фолликулярная жидкость содержит фибриноген, что приводит к образованию кровяных сгустков уже через несколько минут после аспирации. Если ооцит находится в таком сгустке, его будет достаточно сложно обнаружить и впоследствии отмыть. Для преодоления этой проблемы используются два основных подхода: 1. Фолликулярную жидкость просматривают под микроскопом сразу после аспирации и найденные ооциты незамедлительно помещают в среду для отмывки. 2. Фолликулярную жидкость собирают в пробирки, содержащие среду с гепарином, предотвращающую образование кровяных сгустков. Как правило, в большинстве лабораторий руководствуются вторым подходом. При этом используется гепарин в концентрации 50 МЕ/мл. Этот раствор в объеме 1 мл добавляется в пробирки объемом 8 - 10 мл, что дает конечную концентрацию гепарина в фолликулярной жидкости 5 - 8 МЕ/мл. Известно, что гепарин не оказывает влияния на оплодотворение и последующее развитие эмбриона. Комплексы ооцит-cumulus перед помещением в культуральную среду обязательно отмывают в специальной среде. После того как аспирированная фолликулярная жидкость попадает в эмбриологическую лабораторию, она незамедлительно просматривается на присутствие комплексов ооцит-cumulus. Для этого содержимое пробирок переливается в чашки Петри диаметром 9 см и исследуется под стереомикроскопом или инвертированным микроскопом при небольшом увеличении. Как правило, комплексы ооцит-cumulus видны и невооруженным глазом как блестящие слизистые комки или тяжи диаметром 0,5 – 1 см. Найденные ооциты помещаются в среду для отмывки, содержащую HEPES-буфер, позволяющий манипулировать с ооцитами на воздухе без риска изменения рН в щелочную сторону (такие среды производятся большинством фирм, специализирующихся на производстве сред для ЭКО), затем отмываются в культуральной среде и помещаются в лунку 4-луночной чашки либо в специальную чашку для ЭКО, где в дальнейшем будет проводиться оплодотворение ооцитов и культивирование эмбрионов. Также допускается культивирование в небольших (5 – 10 мкл) каплях среды, покрытых слоем минерального масла, предварительно эквилиброванного с культуральной средой в присутствии 5% С02. Преимуществами культивирования под маслом являются: препятствование попаданию в культуральную среду микроорганизмов и частичек пыли, возможность культивирования в небольших каплях среды, что важно при оплодотворении спермой с небольшой концентрацией активных сперматозоидов, а также замедление испарения воды и выхода CO2 из среды вне инкубатора. Однако, если капли со средой под маслом слишком долго находились вне инкубатора, возвращение к исходному равновесию влажности и концентрации CO2 займет гораздо больше времени, чем в отсутствие масла. Манипуляции с ооцитами проводят с помощью оттянутых стерильных пастеровских пипеток, имеющих небольшую резиновую грушу на конце, либо стеклянных (пластиковых) капилляров, присоединенных к микроаспиратору. Существуют и другие способы манипуляций с ооцитами и эмбрионами – выбор зависит от опыта и желания эмбриолога. Сразу после помещения ооцитов в культуральную среду необходимо оценить количество, качество и степень зрелости полученных комплексов ооцит-cumulus. Классификация комплексов ооцит-cumulus, применяемая в клинике Bourn Hall, Кембридж
Оценка степени зрелости ооцитов по состоянию комплексов ооцит-cumulus, как правило, субъективна и часто не отвечает истинному состоянию ооцита. Асинхронность в созревании ядра ооцита, ооплазмы и клеток cumulus достаточно часто встречается в циклах стимуляции суперовуляции при ЭКО. Однако более точное определение степени зрелости (если клетки corona radiata и cumulus удаляют ферментативно или механически) может привести к травматизации ооцита и увеличению риска полиспермии при оплодотворении. На рис.2 представлены данные по распределению ооцитов, полученных в ходе стимуляции суперовуляции, по степени зрелости. Оценка производилась после удаления клеток cumulus.
Рис.3. Ооцитарно-фолликулярные комплексы. а – незрелый; б – зрелый; в – перезревающий. Микрофотографии живых объектов в фазовом контрасте. ОБРАБОТКА СПЕРМЫ ПЕРЕД ОПЛОДОТВОРЕНИЕМ ООЦИТОВ in vitro Эякулят для ЭКО получают путем мастурбации в стерильный контейнер. После полного разжижения спермы, происходящего при комнатной температуре через 30 - 60 мин, приступают к ее обработке. Предварительно необходимо провести анализ концентрации сперматозоидов, их подвижности и морфологических характеристик по стандартной методике ВОЗ. Перед тем как добавлять сперму в культуральную среду с ооцитами, необходимо ее обработать в целях удаления семенной плазмы и получения максимально полноценной фракции прогрессивно подвижных сперматозоидов. На практике применяются два основных метода обработки спермы - центрифугирование- флотация (процедура swim-up) и градиентное центрифугирование. При использовании методики swim-up 1 – 2 мл спермы помещают в коническую 10 – 15-миллиметровую пробирку, добавляют 5 - 10 мл среды для отмывки * и центрифугируют 5 – 10 мин при ускорении 1200 g. Затем супернатант удаляют, осадок ресуспендируют в 2 – 3 мл среды и вновь центрифугируют. После удаления супернатанта 1 – 2 мл свежей среды осторожно наслаивают на осадок, пробирку помещают в CO2-инкубатор при 37°С на 30 – 60 мин. В течение этого времени подвижные сперматозоиды должны мигрировать в наслоенную среду, оставив на дне пробирки неподвижные сперматозоиды, дебрис и иные клетки. Если пробирки будут установлены наклонно, увеличится площадь контакта осадка со средой и, соответственно, выход подвижных сперматозоидов. Для определения концентрации и подвижности сперматозоидов в надосадочной жидкости берется аликвота 10 или 50 мкл. Затем необходимое количество чистого супернатанта используется для инсеминации. Важным шагом вперед в методике обработки спермы стало внедрение метода центрифугирования в градиенте Перколла. Перколл представляет собой суспензию силиконовых гранул 15 – 30 нм в диаметре, покрытых слоем поливинилпирролидона (PVP), поскольку в чистом виде они токсичны для клеток. Особенностью Перколла является очень низкая осмолярность – 25 мОсм/л, поэтому при разведении в среде до различных концентраций, соответствующих различным плотностям (от 1,01 до 1,13 г/л), осмолярность растворов остается постоянной. Растворы Перколла (40 и 90%) готовятся из 100% раствора, представляющего собой смесь 9 частей Перколла и 1 части 10-кратно концентрированной среды для отмывки. Прерывистый градиент плотности достигается путем помещения 1,5 мл 40%-го Перколла на 1,5 мл 90%-го в конической пробирке; сверху аккуратно наслаивается сперма (1 – 2 мл), и вся эта трехслойная колонка центрифугируется 15 мин при ускорении 700 g. После центрифугирования в осадок попадают только функционально нормальные сперматозоиды; неподвижные и аномальные сперматозоиды, а также лейкоциты и другие клетки спермы задерживаются на границе 40 и 90%-q фракций. Осадок отбирается пастеровской пипеткой и два раза отмывается в специальной среде, как и в случае применения методики swim-up (см. выше). Последний метод, по мнению многих авторов, является более предпочтительным, сочетая в себе хорошую сепарацию и высокий выход фертильных сперматозоидов. Кроме того, описано и защитное действие Перколла: он не позволяет попасть в осадок дефектным сперматозоидам, лейкоцитам и другим клеткам спермы, производящим большое количество свободных радикалов, способных повреждать мембраны сперматозоидов. Таким образом, чем более благоприятно соотношение жизнеспособных сперматозоидов и дефектных, тем меньше вероятность повреждений первых. ОПЛОДОТВОРЕНИЕ ООЦИТОВ in vitro Много споров и разночтений вызывает вопрос о времени введения сперматозоидов в среду, где культивируются ооциты. Наиболее общепринятым считается, что между выделением первого полярного тельца ооцита (достижением стадии М II) и добавлением спермы должно пройти около 4 ч, тогда способность такого ооцита к оплодотворению и последующему дроблению будет максимальной. Преовуляторный фолликул на момент аспирации (обычно 36 ч после введения хорионического гонадотропина - ХГ, имитирующего пик эндогенного ЛГ в момент овуляции при естественном цикле), как правило, содержит ооцит на стадии М II. В естественных условиях овуляция, а значит, и возможность оплодотворения наступает через 38 - 40 ч после пика ЛГ. На практике преинкубация ооцитов перед инсеминацией составляет от 2 до 6 ч. Данные по влиянию времени инкубации на оплодотворяемость ооцитов, дробление эмбрионов и беременность разноречивы. По данным К. Yanagida с соавт., исследовавших такую зависимость при инкубации ооцитов в течение 1 - 11 ч перед оплодотворением (применялся метод интрацитоплазматической микроинъекции сперматозоида в яйцеклетку - ИКСИ), способность ооцитов к оплодотворению, последующему дроблению и имплантации статистически достоверно снижается при инкубации их более 9 ч. Достоверных различий при инкубации в течение 1 - 9 ч не было обнаружено. В другом исследовании было показано, что инкубация более 9 ч перед оплодотворением наиболее оптимальна для последующего прохождения всех вышеуказанных процессов при ИКСИ; исследователи предполагают, что это связано с дозреванием цитоплазмы ооцита, необходимым для его активации при оплодотворении. Важным моментом в обеих работах является то, что инкубация ооцитов происходила в присутствии клеток cumulus и corona radiata. Известно, что созревание ооцита полностью зависит от окружающих клеток фолликулярного эпителия, поставляющих в ооплазму РНК и белки, необходимые для развития будущего организма до включения его собственного генома, а также белковые факторы, отвечающие за процесс оплодотворения. Было показано, что дозревание ооцитов in Ditro со стадии GV до стадии МII при интактном cumulus происходило с большей вероятностью, причем последующее их оплодотворение и дробление было лучше. Несмотря на расхождение данных, большинство авторов считает, что преинкубация обязательно необходима, а ее оптимальная длительность подбирается эмпирически в каждой лаборатории. При этом окно оплодотворения для зрелого ооцита достаточно широко, однако преждевременное оплодотворение недозревших ооцитов может негативно повлиять на исход дробления и имплантации эмбрионов. Помимо фактора времени, в инсеминации важным является и количественный фактор. Количество прогрессивно подвижных сперматозоидов обычно должно составлять 50 - 100 тыс. на 1 мл среды (при культивировании в относительно большом объеме среды) либо на ооцит (при культивировании в микрокаплях под минеральным маслом). Подбирая концентрацию сперматозоидов при оплодотворении ооцитов in vitro, нужно иметь в виду, что при добавлении менее 50 тыс. активно подвижных сперматозоидов на 1 мл частота оплодотворения будет существенно снижена, а при использовании очень высоких концентраций возникают побочные эффекты: полиспермия (проникновение более одного сперматозоида в ооцит при оплодотворении), снижение жизнеспособности полученных эмбрионов (за счет повреждения кислородными радикалами, при попадании погибающих или мертвых сперматозоидов, либо воздействия избыточного количества литических акросомальных ферментов). Однако это правило реализуется лишь в случае нормальной морфологии сперматозоидов, при наличии необходимой концентрации активно подвижных сперматозоидов в эякуляте, отсутствии дефектов акросомальной реакции или отсутствии больших концентраций антиспермальных антител в сперме (MAR-тест менее 50%). При наличии этих и других отрицательных факторов, а также при неудаче оплодотворения в предыдущей попытке ЭКО концентрация сперматозоидов может быть повышена путем снижения объема среды культивирования (культивирование в микрокаплях, соломках для криоконсервации, микрокапиллярах), однако это далеко не всегда приводит к желаемым результатам. Для облегчения проникновения сперматозоида в ооцит клетки cumulus и corona radiata могут быть удалены ферментативно и механически, однако это повышает риск полиспермии.
ОПЛОДОТВОРЕНИЕ – ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫОплодотворение представляет собой слияние двух гамет - ооцита и сперматозоида, влекущее за собой слияние их гаплоидных наборов хромосом и развитие нового организма. Зрелый ооцит к моменту оплодотворения представляет собой одну из наиболее больших клеток организма - 110 - 120 мкм в диаметре, окруженную блестящей оболочкой (zona pellucida), несколькими слоями клеток лучистого венца (corona radiata) и большим числом клеток яйценосного бугорка (cumulus oophorus). К этому времени в ооците, как правило, уже завершилось первое деление мейоза, в результате которого отделилось первое полярное тельце, а второе деление мейоза находится на стадии метафазы. Хромосомы располагаются в ряд, образуя метафазную пластинку, непосредственно под полярным тельцем. На этой стадии в ооците происходит блок мейоза, который снимается лишь при проникновении сперматозоида. Зрелый сперматозоид имеет уплощенную грушевидную головку длиной около 6 мкм и шириной в экваториальном сегменте около 4 мкм, состоящую главным образом из ядра и акросомы, которая содержит литические ферменты и расположена в виде шапочки над верхней половиной головки. Хвост сперматозоида имеет длину около 50 мкм и начинается от головки в районе шейки, где расположены центриоль и комплекс митохондрий. Митохондрии отвечают за обеспечение энергией процесса движения сперматозоида, осуществляемого хвостом. В структуре сперматозоида нет ничего лишнего, все имеет только одну цель – доставить генетический материал, содержащийся в головке сперматозоида, в ооцит. Способность сперматозоида к оплодотворению in vivo или In vitro появляется лишь после капацитации, под которой in vivo понимается весь комплекс биохимических и ультраструктурных изменений, которые претерпевает сперматозоид, проходя путь через женский половой тракт до встречи с ооцитом. Эти изменения затрагивают в основном мембрану головки сперматозоида. Капацитация in vitro происходит во время обработки и инкубирования спермы до оплодотворения, однако она невозможна при отсутствии в средах для отмывки и культивирования альбумина. При оплодотворении in vivo в трубе присутствует лишь небольшое количество сперматозоидов, проделавших весь долгий путь от влагалища до ампулярного отдела маточной трубы. Для нормального оплодотворения in vitro их необходимо не менее 50 тыс. на ооцит. Однако при подсчете количества сперматозоидов, непосредственно атакующих ооцит in vitro, их насчитывается до 2 - 3 тыс. До сих пор неясно, почему количество сперматозоидов должно быть так велико в искусственных условиях. Возможно, это объясняется недостаточной физиологичностью среды либо большим размером массы cumulus у ооцитов, получаемых при ТВП, чем in vivo. Прежде чем попасть в ооцит, сперматозоид должен преодолеть несколько барьеров. Первым из них является cumulus, представляющий собой растянутый матрикс, состоящий преимущественно из полигиалуроновой кислоты, с редко расположенными клетками. Преодолеть этот барьер может только капацитированный сперматозоид с интактной акросомой. По мере продвижения внутрь cumulus поведение сперматозоида изменяется: резко возрастает скорость, двумерные движения становятся трехмерными - наступает фаза гиперактивности. In vitro первый барьер сперматозоидам помогает преодолевать фермент гиалуронидаза, выделяющаяся при разрушении акросом гибнущих сперматозоидов; однако такая ситуация не является физиологичной. После прохождения cumulus сперматозоид достигает zona pellucida, где происходит его связывание с рецептором. В отличие от мышей, рецепторы zоnа pellucida которых давно выделены и охарактеризованы, таковые человека до сих пор точно не определены. Имеется предположение, что это так называемый антиген к оплодотворению - FA-1, гликопротеин, который при добавлении в среду полностью блокирует связывание сперматозоидов с zona pellucida. Связывание сперматозоида возможно только при интактной акросоме и нормальной морфологии головки, поскольку рецепторы сперматозоида к гопа pellucida расположены на акросоме. Затем происходит акросомная реакция - мембрана акросомы и цитоплазматическая мембрана ооцита сливаются, содержимое акросомы (главным образом, фермент акрозин, способный к локальному растворению гликопротеинов, из которых состоит гопа pellucida) выбрасывается в месте связывания с гопа pellucida и сперматозоид интенсивно продвигается сквозь оболочку ооцита, все еще находясь в фазе гиперактивности. Попадая в перивителлиновое пространство, сперматозоид прикрепляется к рецепторам на мембране ооцита комплементарными рецепторами, расположенными на экваториальной части головки под акросомой. Связывание сперматозоида с рецепторами на плазматической мембране мгновенно вызывает так называемую кортикальную реакцию - массовый экзоцитоз гранул, расположенных по периферии ооцита (cortex}, что приводит к необратимым изменениям zona pellucida, делающим ее непроходимой для остальных сперматозоидов. Это является основным механизмом предотвращения полиспермии у млекопитающих. Далее начинается процесс слияния мембран сперматозоида и ооцита, в результате которого сперматозоид целиком как бы заглатывается ооцитом (процесс очень напоминает фагоцитоз). Сразу после слияния гамет ядерная мембрана сперматозоида разрушается, хроматин деконденсируется под влиянием факторов ооплазмы. Одним из этих факторов, возможно, является так называемый фактор деконденсации ядра сперматозоида (SNDF). Ооцит также активируется, мейоз возобновляется, выделяется второе полярное тельце. Механизм активации ооцита пока изучен недостаточно, однако известно, что фактор активации выделяется сперматозоидом. Ядерный материал ооцита окружается оболочкой - формируется женский пронуклеус. Вокруг хроматина сперматозоида формируется мужской пронуклеус, в обоих пронуклеусах идет синтез ДНК. Мужской и женский пронуклеусы начинают движение по направлению друг к другу и встречаются в центре ооцита. Через несколько часов после встречи мембраны пронуклеусов разрушаются, и генетический материал обеих гамет сливается (сингамия). На этом этапе процесс оплодотворения завершается - возникает зигота. Хроматин зиготы конденсируется, и хромосомы подготавливаются к первому делению дробления. На следующий день после аспирации ооциты переносят в лунку со свежей культуральной средой и очищают от клеток лучистого венца пастеровской пипеткой с оттянутым до диаметра 150 - 160 мкм кончиком и просматривают на предмет присутствия признаков оплодотворения. Пронуклеусы видны в ооците даже при наблюдении в стереомикроскоп х 80. Они появляются, как правило, через 10 - 16 ч после добавления сперматозоидов в среду с ооцитами и исчезают через 6 - 8 ч после появления. Если присутствуют оба пронуклеуса - оплодотворение считается нормальным. Если их не удается обнаружить - оплодотворение не состоялось. Если виден один пронуклеус либо больше двух - произошло аномальное оплодотворение. Примерно в 30% случаев в ооцитах после оплодотворения in vitro не выявляются пронуклеусы, что может быть связано как с несостоявшейся пенетрацией ооцита (низкая концентрация активных сперматозоидов, дефекты в механизмах адгезии сперматозоида, отсутствие рецепторов на zona pellucida и/или мембране ооцита), так и с незрелостью ооцита на момент оплодотворения, а также с наличием хромосомных аномалий у ооцита (диплоидия, анеуплоидия). При наличии в ооплазме одного пронуклеуса (около 3 - 6%) в половине случаев оплодотворение все же происходит, однако пронуклеусы формируются асинхронно. Происхождение таких зигот может быть различным: гиногенетическим (из ооцита), андрогенетическим (из сперматозоида) либо возникшим в результате слияния мужского и женского пронуклеусов. Отличить на практике это невозможно, поэтому рекомендуется: во-первых, просматривать ооциты на следующий день после инсеминации несколько раз, чтобы избежать ошибки; во- вторых, не переносить в полость матки эмбрионы, полученные из однопронуклеарных зигот. Полипронуклеарные зиготы - 3 и более пронуклеусов - составляют, как правило, 5 - 10% от всех оплодотворенных ооцитов и возникают главным образом при проникновении в ооцит более одного сперматозоида (в случае добавления избыточного количества сперматозоидов при инсеминации, при дефектах кортикальной реакции, при незрелости или перезрелости ооцита). Также описаны случаи неотделения второго полярного тельца после завершения мейоза, генетический материал которого формирует третий пронуклеус. Полипронуклеарные зиготы, как правило, не развиваются нормально, эмбрионы, полученные из таких зигот нельзя переносить в полость матки. В естественных условиях такие эмбрионы иногда имплантируются, однако чаще всего такая беременность заканчивается выкидышем либо мертворождением. Рис. 4. Яйцеклетки и зародыши человека на различных этапах культивирования. а – ооцит с первым полярным тельцем; б – пронуклеусы: в и г – зародыши на стадиях 4 и 8 бластомеров. Микрофотографии живых объектов в фазовом контрасте. ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ЭМБРИОНОВ Эмбрионы, полученные после оплодотворения ооцитов одной и той же пациентки, часто отличаются по скорости дробления и морфологическим параметрам. Общепризнанным считается, что максимальную способность к имплантации имеют эмбрионы с наибольшей скоростью дробления, бластомеры которых имеют регулярную форму, а безъядерные фрагменты отсутствуют. Такие эмбрионы относят к классу 1 (А). Градация эмбрионов по качеству является условной и различается в разных лабораториях. Однако в основе ее лежит, как правило, характер фрагментации эмбриона, форма и размер бластомеров. Так, эмбрион с неравными бластомерами и/или фрагментами цитоплазмы, занимающими менее 10% объема, соответствует классу 2 (В); при наличии фрагментации 10 - 50% - классу 3 (С), более 50% - классу 4 (D). Работы по анализу влияния качества переносимых в полость матки эмбрионов на частоту их имплантации многочисленны, но трудносопоставимы в силу разных методик оценки качества. Около 20% переносимых эмбрионов А-В класса имплантируются, однако эта частота падает до 1,5% для сильно фрагментированных эмбрионов. Впечатляют результаты клиники Bourn Hall (Англия), в которых показано, что 90% пациенток, забеременевших после ЭКО и ПЭ, получали при переносе эмбрионов хотя бы один эмбрион класса А. В той же работе не было выявлено зависимости между качеством переносимых эмбрионов и частотой невынашивания беременности. СТРАТЕГИЯ ПЕРЕНОСА ЭМБРИОНОВ Количество переносимых эмбрионов обычно составляет не более 2 - 3, поскольку при увеличении числа эмбрионов до 4 и более частота беременности, как правило, не возрастает, но увеличивается риск моногоплодной беременности, что влечет за собой серьезные проблемы акушерского характера. Однако в отдельных случаях допускается перенос большего числа эмбрионов - при многократных неудачных попытках ЭКО и ПЭ и при возрасте пациентки старше 40 лет. В данном случае при последующих переносах шанс наступления беременности снижается, и авторы пытаются использовать возможность наступления беременности за счет увеличения количества переносимых эмбрионов. Но такой подход не является научным, так как в этих случаях не всегда ясна причина неудач, т. е. мы часто имеем дело с так называемым «бесплодием неясной этиологии». Что касается интервала между моментом оплодотворения ооцитов и временем переноса эмбрионов, то здесь существует несколько основных подходов. На заре развития метода Эдварде и Стептоу переносили в полость матки эмбрионы, достигшие стадии 8 - 16 бластомеров на 3 - 4-е сутки культивирования, имитируя естественные условия. Однако впоследствии было выявлено, что более ранние эмбрионы также пригодны для переноса и имплантируются с той же вероятностью. Через 48 ч после аспирации фолликулов (2-е сутки культивирования) эмбрионы, как правило, находятся на стадии 2 - 4 бластомеров, но встречаются и стадии 6 - 8 бластомеров. Перенос эмбрионов на 2-е сутки наиболее общепринят: уже имеется возможность отобрать эмбрионы по качеству и скорости дробления, однако пребывание в условиях культуры, являющихся в любом случае менее оптимальными, чем естественные, еще не слишком длительно. Интересен тот факт, что способность эмбриона к имплантации напрямую зависит от скорости его дробления. Так, в исследовании Staessen с соавт. при переносе эмбриона хорошего качества на стадии 2 и 4 бластомеров частота имплантации составила 14 и 21% соответственно. В другой работе сообщается, что если перенесенные эмбрионы достигали стадии не более 2 бластомеров, частота наступления беременности составляла 9,3%, но возрастала до 35,8%, если хотя бы один эмбрион был на более чем двуклеточной стадии. На 3-и сутки культивирования нормально развивающиеся эмбрионы достигают стадии 6 - 8 бластомеров и выше. К этому моменту выбор эмбрионов для переноса облегчается - часть эмбрионов, на 2-е сутки дробившихся нормально, отстает в развитии либо останавливается. Однако при анализе качества многоклеточных эмбрионов существует опасность принять безъядерные фрагменты за бластомеры, становящиеся к этой стадии близкими по размеру. В большинстве лабораторий, проводящих ЭКО и ПЭ, перенос эмбрионов осуществляется на 2 - 3- и сутки культивирования, причем статистически достоверной разницы между частотой наступления беременности после переноса на 2-е или 3-и сутки не было обнаружено (соответственно 21,9 и 23,5%). Выбор времени переноса должен осуществляться на основании анализа интенсивности и равномерности дробления эмбрионов: если выбор эмбрионов на 2-е сутки затруднен, перенос можно отложить на 24 ч. На 4 - 5-е сутки пребывания в культуре при применении стандартных сред и методик культивирования лишь небольшая часть эмбрионов достигает стадии морулы и бластоцисты, и частота наступления беременности не возрастает по сравнению с переносом на 2 - 3-и сутки. Однако при использовании культуральных систем, отвечающих метаболическим потребностям эмбрионов на этой стадии, можно добиться хороших результатов. Так, при культивировании эмбрионов в присутствии клеток линии Vero (клетки почки обезьяны) было показано, что 60% эмбрионов достигают стадии бластоцисты, а перенос бластоцист дает высокий процент беременности. Особенно это относится к пациенткам с повторными неудачами при переносе более ранних эмбрионов. По данным разных авторов, беременность наступала в 37 - 40% случаев переноса эмбрионов на стадии бластоцисты. Серьезным возражением против ко-культивирования эмбрионов человека в присутствии клеток других животных является возможность вирусного заражения, поэтому активно разрабатываются среды, оптимизирующие условия культивирования более поздних эмбрионов (>3 суток). Примером такой среды может служить среда Гарднера (G 2). При культивировании в ней эмбрионов с 3-го по 5-й день бластоцисты формировались из 52% зигот первого дня, частота имплантации и беременности составляла соответственно 23 и 38%. Сам Гарднер сообщает о 50%-й имплантации бластоцист, полученных при последовательном культивировании в средах G 1,2 (1 - 2-й день) и G 2,2 (3 - 5-й день), в то время как достоверной разницы между частотой наступления беременности после переноса эмбрионов на 3-й и 5-е сутки не наблюдалось (66 и 71% соответственно). Возможность культивирования до стадии бластоцисты открывает большие возможности при отборе «лучших» эмбрионов, делает более физиологичным момент попадания эмбрионов в полость матки, а также существенно увеличивает процент имплантации, что позволяет переносить не более 2 бластоцист, не опасаясь возникновения осложнений, связанных с многоплодием, или снижения вероятности наступления беременности. ТЕХНИКА ПЕРЕНОСА ЭМБРИОНОВ Техника переноса эмбрионов за двадцать лет развития метода практически не изменилась. Здесь мы рассмотрим лишь последовательность действий эмбриолога, не касаясь гинекологических аспектов переноса. Перенос эмбрионов осуществляют через цервикальный канал в полость матки пациентки с помощью специального катетера. Существует большой выбор таких катетеров, однако наиболее распространенными в мире являются: катетеры Bourn- Wallace, Frydman и Cook-Soft transfer для неосложненных переносов и катетер T.D.T. для осложненных переносов (при загибе матки, извилистом ходе или спазме цервикального канала). Катетер присоединяют к 1-миллилитровому шприцу, набирают столбик (около 0,2 мл) свежей, нагретой до 37°С культуральной среды, затем давление со шприца снимают, шприц переводят в исходное положение и продолжают набирать: сначала пузырек воздуха, затем каплю среды без эмбрионов, опять пузырек воздуха, каплю среды с эмбрионами, отобранными для переноса, пузырек воздуха и еще одну каплю без эмбрионов. Такая последовательность необходима для обеспечения сохранности эмбрионов во время процедуры переноса и маркирования их местоположения. Катетер с эмбрионами передают гинекологу для осуществления переноса: содержимое, за исключением начального столбика среды, всего около 20 - 50 мкл, попадает в полость матки. Оставшейся средой промывают катетер и смыв рассматривают под стереомикроскопом, чтобы убедиться, что все эмбрионы перенесены в полость матки. СТИМУЛЯЦИЯ СУПЕРОВУЛЯЦИИ В ПРОГРАММЕ ЭКО И ПЭ Для успешного выполнения программы ЭКО необходимо добиться созревания нескольких доминантных фолликулов - суперовуляции. Это значительно повышает возможность изъятия и оплодотворения яйцеклетки. Кроме того, отмечено, что при пересадке нескольких оплодотворенных яйцеклеток беременность развивается чаще, причем развивается один эмбрион. Этот феномен получил название "функция помощи". Период развития от раннего преантрального до преовуляторного фолликула у человека занимает примерно 85 дней, или 3 менструальных цикла (рис.5). После 65 дней роста финальная когорта, состоящая из 15 - 20 малых полостных фолликулов, вступает в гонадотропинзависимую фазу роста. В спонтанном менструальном цикле в яичнике под влиянием гонадотропинов (Гн), главным образом фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), развивается один фолликул, а остальные подвергаются атрезии. Секреция ФСГ происходит в аденогипофизе и регулируется гонадотропин-рилизинг гормоном (ГнРГ), вырабатываемым гипоталамусом. Доминантный фолликул обладает высокой стероидогенной активностью и продуцирует эстрадиол (Е2), необходимый для секреторной трансформации эндометрия и обеспечения условий для имплантации эмбриона. Когда секреция E2 достигает критического уровня, происходит резкое возрастание уровня лютеинизирующего гормона (ЛГ), стимулирующего овуляцию и лютеинизацию лопнувшего фолликула. ЛГ, как и ФСГ, секретируется клетками аденогипофиза и находится под влиянием ГнРГ. Изучение динамики концентрации E2 в периферической крови показало, что период активного стероидогенеза составляет 5 - 6 дней, после чего концентрация е2 резко снижается. Мониторниг E2 используется в клинической практике для определения степени функциональной зрелости доминантного фолликула. На месте разорвавшегося фолликула формируется желтое тело, которое является основной стероидпродуцирующей структурой яичника, определяющей изменения концентрации Е2 и прогестерона (П) на протяжении лютеиновой фазы менструального цикла. Первая беременность, завершившаяся в 1978 г. рождением Луизы Браун, наступила в результате оплодотворения in vitro единственного ооцита, аспирированного в спонтанном цикле, и переноса одного эмбриона в полость матки. В последующих исследованиях была показана низкая эффективность метода при переносе лишь одного эмбриона, которая составляет при работе в естественном цикле не более 8 - 15% из расчета на один перенос эмбрионов. Это привело к необходимости использования лекарственных препаратов, оказывающих стимулирующее действие на фолликулогенез в яичниках в целях получения нескольких преовуляторных ооцитов. Для стимуляции фолликулогенеза и получения нескольких преовуляторных ооцитов используются гормональные препараты. Рис. 5. Цикл развития доминантного фолликула Стимуляция суперовуляции в современных условиях основана на: § стимуляции выделения собственных эндогенных гонадотропинов кломифеном; § стимуляции экзогенными гонадотропинами (препараты из мочи менопаузальных женщин - препараты человеческого менопаузального гонадотропина (чМГ), содержащие ЛГ и ФСГ (пергонал, неопергонал, хумегон) или ФСГ (метродин); § стимуляции экзогенными гонадотропинами на фоне блокады собственных гонадотропинов препаратами агонистов РГ ЛГ (декапептиды - трипторелин, бусерелин, госерелин, нафарелин и др.). Все эти препараты - синтетические аналоги гонадотропных рилизинг гормонов, и число их постоянно растет. Все они в 50 - 100 раз активнее эндогенных рилизингов. Действие их основано на блокаде собственных гонадотропинов, что позволило некоторым авторам называть этот метод «стимуляция суперовуляции на фоне гипофизэктомии», хотя на самом деле подавляется секреция только гонадотропинов, а не всех тропных гипофизарных гормонов. На фоне снижения уровня собственных гонадотропинов введение экзогенных гонадотропинов позволяет регулировать рост доминантных фолликулов и созревание яйцеклеток. В повседневной практике используются так называемые «длинная схема» и «короткая схема» введения препаратов. При длинной схеме введение агонистов начинают в конце фолликулярной фазы предыдущего цикла, под контролем снижения ЛГ в крови. После наступления устойчивого низкого «плато» ЛГ приступают к введению гонадотропных препаратов. При короткой схеме агонисты вводятся с 1-го дня менструального цикла, гонадотропины - с 3-го или 5-го дня цикла. При любом методе стимуляции суперовуляции постоянно контролируются число фолликулов, темпы их роста и величина фолликулов. До начала стимуляции суперовуляции следует проводить предварительное гормональное обследование, а в период стимуляции - ультразвуковой (УЗ) и гормональный мониторинг. Как правило, исследуется уровень эстрадиола крови и толщина эндометрия. Критериями созревания яйцеклетки, точнее говоря, определением времени, оптимального для забора ооцитов, являются: концентрация эстрадиола не менее 350 пг/мл на 1 фолликул диаметром более 15 мм, толщина эндометрия 0,8 - 1,0 см. Механизм овуляции, в естественном спонтанном менструальном цикле обеспечивающийся выбросом эндогенного ЛГ, в циклах стимуляции суперовуляции имитируется введением ЛГ-подобного препарата - хорионического гонадотропина (ХГ), получаемого из мочи беременных женщин. Через 35 - 36 ч после введения овуляторной дозы ХГ (10000 ед.) производится трансвагинальная пункция яичников (ТВП) в целях аспирации зрелых ооцитов. После их оплодотворения in vitro и инкубации в специальной питательной среде через 48 - 72 ч, в зависимости от интенсивности дробления, производится перенос эмбрионов на ранней стадии дробления в полость матки пациентки. После пересадки эмбрионов рекомендуется вводить поддерживающие дозы хорионического гонадотропина по 1500 ед. и дексаметазона по 0,25 мг, последний подавляет иммунную реакцию отторжения плодного яйца. Препараты вводят до констатации беременности или до срока очередных менструаций (в случае неудачи). ОСНОВНЫЕ ПРОБЛЕМЫ, ВОЗНИКАЮЩИЕ ПРИ ПРИМЕНЕНИИ ЭКО И ПЭ Программа ЭКО и ПЭ сложна в связи с тем, что она многоэтапная, но не все этапы можно объективно проконтролировать. Остановимся на некоторых проблемах, возникающих при применении этого метода. У женщины вовремя одного естественного менструального цикла можно получить в среднем не более одной яйцеклетки. Манипулируя с яйцеклеткой, ее легко потерять или травмировать, поскольку ее размеры, включая corona radiata, не превышают 500 мк. Яйцеклетка может быть потеряна, например, в пипетке, в капле питательной среды и т. п. Следовательно, необходим резерв клеток. В связи с этим возникла идея стимуляции так называемой суперовуляции, т. е. получения большего числа яйцеклеток (5 - 10 шт.) за счет применения антагонистов эстрогенов и менопаузальных гонадотропинов ФСГ и ЛГ. Однако увеличение количества яйцеклеток влечет за собой другой отрицательный фактор - некоторые из них могут оказаться неполноценными, с нарушением оогенеза или с хромосомной патологией, а другие могут стать на путь обратного развития в процессе фолликулогенеза. Так что не все полученные яйцеклетки могут быть оплодотворены и нормально развиваться. Высокая частота самопроизвольных абортов (26,2%) после ЭКО является относительным показателем возможной патологии плодов. Эти данные подтверждаются результатами исследования хромосом яйцеклеток и эмбрионов ранних стадий развития. Известно, что от 35 до 50% нефертилизованных ооцитов в программе ЭКО имеют хромосомные аномалии. Выявлена высокая степень зависимости хромосомных аномалий от возраста беременных женщин. Так, анэуплоидия диагностируется у 47% женщин после 35, лет и у 25% молодых женщин; после кломифена - у 55%, после ЧМГ - у 23%, после чистого ФСГ - у 22%. Значительно чаще хромосомная патология обнаруживается у фрагментированных эмбрионов (33%), чем у нормальных (20%). Анализ ооцитов и эмбрионов, полученных в программе ЭКО, свидетельствует о том, что основным фактором, обусловливающим высокую частоту хромосомных аномалий, является возраст беременных. Увеличение частоты хромосомной патологии с увеличением возраста имеет тенденцию, аналогичную таковой в популяции, однако показатели этой патологии в 2 раза выше, чем популяционные данные спонтанной фертильности. Высокая частота хромосомных аномалий в нефертилизованных ооцитах свидетельствует о том, что множественная наведенная стимуляцией овуляция, или суперовуляция, сопровождается высокой частотой хромосомной патологии ооцитов, которые созревают в аномальных условиях в отсутствие физиологической селекции и борьбы за существование доминирующего фолликула, который подавляет рост других фолликулов в одном пуле, возможно, не имеющих тенденции к нормальному развитию. Начато внедрение в практику методики флуорисцентной (in situ) гибридизации (FISH), обеспечивающей преимплантационную диагностику врожденной хромосомной патологии. Отдельные бластомеры извлекаются из эмбриона и проводится их FISH- анализ. Эмбрионы, по которым получено положительное заключение, могут быть перенесены в полость матки для дальнейшего развития, а эмбрионы с обнаруженной патологией не переносятся (в целях профилактики таких заболеваний как гемофилия, синдром Патау, Дауна, Эдвардса, Клайнфельтера, моносомия Шершевского-Тернера). Достижением самых последних лет является генная терапия, применение которой возможно и на самых ранних стадиях развития эмбрионов. При этом выполняется не только диагностика, но и лечение больных зародышей. Особенностью ЭКО является очень высокая частота многоплодных беременностей. Если при естественном зачатии рождается одна двойня на 70 - 80 родов, одна тройня на 9000 родов и одна четверня на 50 000 родов, то после ЭКО многоплодие, включая двойни, тройни и четверни, встречается примерно в половине(!) всех беременностей. Хорошо известно, что многоплодие, особенно когда беременность больше, чем двумя плодами, создает высокий риск осложнений и для матери, и для ребенка, как в процессе беременности, так и родов. Сегодня разработаны способы удаления (редукции) "лишних" плодов (больше двух) под ультразвуковым контролем. На самом деле лишние плоды не удаляют, а путем введения специальных растворов добиваются того, что они перестают развиваться и постепенно рассасываются. Эта процедура производится на 7 - 8-й неделе беременности и, как правило, не сопровождается угрозой выкидыша остальных плодов. Рассасывание лишних плодов может происходить и само по себе, без каких-либо вмешательств, также до 7 - 8 нед. Имеются данные о возможности возникновения y человека таких «ошибок оплодотворения», как гино- и андрогенез. В программе ЭКО и ПЭ, к сожалению, присутствует возможность возникновения ряда грозных осложнений акушерско-гинекологического характера, которые существуют и в естественных условиях. Основное из них - внематочная беременность, которая может наступить, даже если маточные трубы у женщины непроходимы, а также в случае, если они удалены недостаточно радикально (беременность наступает в культях труб). Вероятность наступления внематочной беременности в программе ЭКО и ПЭ 10,6%. Следует также знать, что нередко при лечении бесплодия методом ЭКО может иметь место такое осложнение как синдром гиперстимуляции яичников (СГЯ). Синдром гиперстимуляции яичников (СГЯ) - комплекс патологических симптомов, возникающих на фоне применения стимуляторов овуляции, характеризующийся значительным увеличением яичников, иногда разрывом их и кровотечением; наличием выпота в брюшной и плевральной полостях, возникновением тромбоэмболий магистральных сосудов, многоплодной беременностью и пр. В последние годы, в связи с широким распространением лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения, включающего как первый этап стимуляцию суперовуляции, СГЯ привлекает все большее внимание. Первые описания СГЯ появились еще в 40-х годах, S. Ridberg сообщил о значительном увеличении яичников после применения гонадотропинов. В 1962 г. A. Southan, N. Ivanovsky опубликовали случаи СГЯ после приема значительных доз кломифена: в 1970 г. описаны случаи СГЯ при комбинированной терапии кломифеном и гонадотропинами [Roland M.]. Е. Raban и соавт. в 1967 г. предложили классификацию СГЯ, которой пользуются до сих пор все клиницисты: • легкая форма, • средней тяжести, • тяжелая. Данные о частоте СГЯ приводит Н. Li в 1993 г. в сборнике, посвященном условиям репродуктивной медицины: — частота легкой формы достигает 23%, — средней тяжести - 10%, — тяжелой - 2%. J. Shenker, D. Weinstein расширили и детализировали классификацию, выделив в каждой из трех форм еще две степени. Легкая форма: 1-я степень - клиническая симптоматика отсутствует, содержание эстрадиола в плазме более 150 мкг, в моче прегнадиола выше 10 мг;2-я степень - к этим биохимическим изменениям присоединяется увеличение яичников до 5 см в диаметре. Форма средней тяжести: 3-я степень - боли, чувство тяжести внизу живота и изменения, описанные во 2-й степени; 4-я степень - присоединяется тошнота, рвота, понос, размеры яичников - более 5 см в диаметре. Тяжелая форма: 5-я степень - к описанным симптомам присоединяется асцит, гидроторакс, яичники более 12 см в диаметре; 6-я степень - состояние крайне тяжелое, помимо асцита и гидроторакса развивается гиперкоагуляция, уменьшается перфузия почек, осложняющаяся олигурией и почечной недостаточностью, яичники резко увеличены, отмечают их разрывы и перекрут. Суммируя представленные данные, можно сказать, что, по-видимому, используемые в программах вспомогательной репродукции способы гормональной стимуляции фолликулогенеза и овуляции вносят свой вклад в увеличение числа таких ошибок. Гибель зародышей в процессе имплантации может быть обусловлена перечисленными выше причинами, недостаточностью второй фазы цикла (изначально существовавшей или возникшей в процессе овариальной стимуляции), а также, возможно, особенностями становления иммунологических отношений эмбриона с организмом матери, вследствие отсутствия трубного периода развития, в который эти отношения начинают активно устанавливаться («фактор ранней беременности» и т.п.). Трудно оценить влияние на гаметогенез и оплодотворение чисто внешних (экологических, антропогенных, социокультурных и т. п.) факторов. Однако они, безусловно, также вносят свой вклад в патологию раннего развития. Таким образом, в большинстве случаев пренатальные потери и приводящая к ним патология у эмбрионов при использовании методов вспомогательной репродукции возникают не необходимо и не случайно, а под влиянием определенных факторов, в том числе и приводящих к нарушению регулирующих репродуктивный процесс механизмов. Элиминация же аномальных гамет, зигот и эмбрионов - процесс как необходимый, так и закономерный, направленный на сохранение постоянства генотипа популяции. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Проблема бесплодия возникла отнюдь не сегодня, она сопровождает человечество еще с древних времен. Современная медицина достаточно глубоко изучила причины возникновения женского и мужского бесплодия. Разработаны как лекарственные, т.е. консервативные, методы терапии бесплодия, так и оперативные. Однако неудовлетворенность достигнутыми результатами привела к разработке нового метода лечения бесплодия - ЭКО и ПЭ, который быстро завоевал позицию лидирующего в этом направлении. В данной работе представлены основные проблемы программы ЭКО и ПЭ и возможные осложнения, возникающие на различных ее этапах. Хотя применение метода ЭКО и ПЭ не позволяет в целом решить возникшую в стране критическую демографическую ситуацию, тем не менее широкое внедрение его в практику здравоохранения поможет избавиться от бесплодия сотням тысяч супружеских пар, а следовательно, осуществить также их психологическую реабилитацию. В заключение необходимо отметить, что благодаря успехам программы ЭКО достигнуты положительные результаты в фундаментальных исследованиях человеческих гамет и эмбрионов. ЛИТЕРАТУРА 1. Экстракорпоральное оплодотворение и его новые направления в лечении женского бесплодия (теоретические и практические подходы): Руководство для врачей / Под. ред. В.И.Кулакова, Б.В.Леонова – М., 2001, 782 с. 2. Никитин А.И., Китаев Э.М., Савицкий Г.А., Иванова Р.Д., Калашникова Е.П. и Устинкина Т.И. Экстракорпоральное оплодотворение у человека с последующей имплантацией эмбриона и рождением ребенка. Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии. – Л., 1987, Т.93, вып.10, с.39-43. 3. Аншина М.Б., Здановский В.М. Если вам нужен ребенок. – М., 1998, 32с. 4. Пшеничникова Т.Я. Бесплодие в браке. – М., 1991, 320с. 5. Сметник В.П.. Тумилович Л.Г. Неоперативная гинекология. Руководство для врачей. – М. 1999, с.476-480. * Для отмывки спермы могут использоваться различные среды, однако они должны быть забуферены HEPES и содержать сывороточный-альбумин (10%), необходимый для капацитации сперматозоидов. |
|
, растворенные в
© 2010 |
|