Курсовая: Вирусы

Курсовая: Вирусы

липидов, окружающего нуклеокапсид. Наружная поверхность двойного липидного

слоя покрыта гликопротеидом, а внутренняя контактирует с белками матрикса

или нуклеокапсида. Все липиды, содержащиеся во внешней оболочке вириона,

имеют клеточное происхождение, так как не обнаружено какого-либо вирус-

специфического обмена липидов. По своему составу липиды вириона очень сходны

с липидами плазматической мембраны клетки-хозяина: в их число входят

холестерин, гликолипиды и фосфолипиды. Клетки различных видов существенно

различаются между собой по липидным компонентам плазматических мембран.

Поэтому липидный состав вируса, формирующегося в данной клетке, точно

соответствует липидному составу ее плазматической мембраны.

Гликопротеиды, содержащиеся в оболочках различных вирусов, обладают как

специфическими свойствами, так и свойствами, общими для всех вирусных

гликопротеидов. Все они находятся на внешней поверхности вириона и могут быть

удалены под воздействием протеаз. Поскольку протеазы отщепляют от интактных

вирионов только гликопротеиды, ясно, что наружу из двойного слоя липидов

выступают лишь эти молекулы вирусных белков. Следует отметить, что протеазы

удаляют лишь часть молекулы гликопротеида. Другая ее часть - «ножка»,

состоящая из высокогидрафобного полипептиада - по-видимому, погружена в

двойной липидный слой и недоступна для протеазы.

Сборка вириона

На первой стадии формирования вириона происходит синтез его индивидуальных

белков. Белки каждого из трех классов синтезируются, по-видимому,

независимо друг от друга и часто на отдельных м РНК.

Гликопротеиды образуются на связанных с мембранами м РНК и в свободном

состоянии в клетках никогда не встречаются. Молекулы белка «созревают» по

мере их передвижения из шероховатого эндоплазматического ретикулума в

гладкий, а затем, возможно, в аппарат Гольджи и, наконец, в плазматическую

мембрану клетки. Присоединение углеводов к белкам происходит при перемещении

последних по внутриклеточным мембранам. В конце концов они выходят на

поверхность клетки, где, вероятно, свободно плавают в жидком двойном липидном

слое плазматической мембраны.

Вирусы, содержащие двухцепочечную РНК (класс III)

Вирусы данного класса были обнаружены у плесеней, высший растений, насекомых

и позвоночных животных. Ни один из этих вирусов не содержит липидов. Их

капсиды состоят из двух слоев - внутреннего (сердцевины) и наружного,

образующего оболочку вокруг сердцевины. В сердцевине находится множество

сегментов двухцепочечной РНК и варьирующее число небольших олигонуклеотидов,

не имеющих, по-видимому, никаких генетических функций. Наиболее тщательно

изучены реовирусы человека, которые, как правило, не вызывают каких-либо

явных патологических симптомов. Исключение составляют, по-видимому,

реовирусоподобные агенты, выделяемые при гастроэнтеритах у детей. Тем не

менее эти вирусы часто выделяют из организма человека, причем в лабораторных

условиях они хорошо размножаются. Некоторые данные получены также об

отдельных вирусах растений и насекомых, содержащих двухцепочечную РНК.

Размножение вирусов животных.

ДНК-содержащие вирусы и ретровирусы.

Поскольку в нормальных клетках нет никаких эквивалентов генетических систем

РНК-содержащих вирусов, такие вирусы способны размножаться лишь в том случае,

если они синтезируют ферменты, необходимые для транскрипции и репликации их

генома. В случае ДНК-содержащих вирусов, напротив, синтез их м РНК происходит

так же, как и м РНК нормальных клеток. Репликация их генома и генома клетки

формально также весьма сходны. Более того, транскрипция и репликация ДНК

большинства вирусов, так же как и клеточной ДНК происходит в ядре. Сходство

основных процессов у клеток и ДНК-вирусов наводит на мысль, что для размножения

последних нет никакой необходимости в индукции каких-то особых ферментов,

отсутствующих в незараженной клетке. Отсюда следует, что для размножения

ДНК-вируса достаточно присутствия белков его капсида, так что геном такого

вируса вполне может состоять только из генов, кодирующих его капсид. Следует,

однако, подчеркнуть, что, хотя такие простые ДНК-вирусы действительно

существуют, жизненный цикл большинства ДНК-вирусов значительно сложнее.

Различные ДНК-вирусы очень сильно отличаются друг от друга как по величине, так

и по сложности их строения. Молекулярный вес ДНК наименьших из них составляет

всего 1,5х106 дальтон, а самых крупных - в 100 раз больше. По мере

увеличения вирусных геномов они становятся все сложнее и сложнее. Возрастает

общее число генов и усложняется механизм репликации ДНК.

Поскольку мелкие ДНК-вирусы способны к интенсивному размножению,

представляется удивительным сам факт возникновения крупных ДНК-вирусов. Одно

из преимуществ, которое может получить вирус при увеличении его генома - это

уменьшение зависимости от клетки.

Парвовирусы

Самыми простыми из всех известных вирусов, вероятно, являются парвовирусы. Их

геном представлен одноцепочечной ДНК с мол. Весом всего 1,5х106

дальтон. Однако для единственного кодируемого этим вирусом продукта - белка его

капсида - даже эта малая молекула слишком велика. Размножение этого крошечного

паразита, по-видимому, действительно полностью зависит от соответствующих

систем клетки-хозяина. Существует два основных класса парвовирусов - автономные

и дефектные. Все до сих пор известные автономные парвовирусы - это вирусы

грызунов; для транскрипции, репликации и других функций эти вирусы используют

соответствующие ферменты клетки-хозяина. Дефектные парвовирусы размножаются

лишь в клетках, которые заражены одновременно аденовирусом, выполняющим

некоторые необходимые функции. До сих пор не найдено нормальных клеток, в

которых могли бы размножаться дефектные парвовирусы. В клетках, находящихся в

стационарной фазе, автономные парвовирусы не размножаются, они размножаются

лишь в клетках ДНК которых уже реплицируется, т.е. в клетках, находящихся в

S-фазе клеточного цикла.

Это ограничение касается типа клеток, поражаемых данными вирусами.

Парвовирусы вызывают аномалии развития у эмбрионов и дефекты растущих тканей

у новорожденных. Они вызывают также нарушения функции кишечника, что,

вероятно, является следствием их размножения в быстро делящихся клетках

крипт.

Дефектные парвовирусы размножаются только в клетках, зараженных

аденовирусом - помощником, и не зависят от фазы клеточного цикла. Их вирусом-

помощником могут быть только аденовирусы. Герпесвирусы также способны

выполнять некоторые из необходимых функций вируса - помощника, однако полные

инфекционные частицы парвовирусов в этом случае не образуются. Именно по этой

причине дефектные парвовирусы называют также «аденоассоциированными»

вирусами (ААВ).

Одно из характерных различий между автономными и дефектными парвовирусами

состоит в том, что геном первых представлен уникальной одиночной цепью ДНК,

а геном дефектных парвовирусов - эквимолярными количествами одноцепочечных

комплелянтарных друг другу молекул ДНК. При гибридизации одноцепочечные

молекулы ДНК, выделенные из вирионов ААВ, легко превращаются в молекулы

двухцепочечных ДНК. Вирионы парвовирусов близки по величине к рибососмам - их

диаметр 20 нм. Не содержащие липидов капсиды этих вирусов состоят из трех

полипептидов различной длины. Молекулярный вес самого большого из них 90000

дальтон. Судя по пептидной карте, малые полипептиды представляют собой

части большого; поэтому полагают, что вирусная м РНК кодирует только

полипептид с мол. весом 90000.

Паповавирусы

Паповавирусы известны лучше других благодаря принадлежащим к этой группе

подробно исследованным онкогенным вирусам - вирусу полиомы и SV40, которые

размножаются лишь в очень узком кругу клеток млекопитающих. Обычно при

изучении онкогенных свойств этих вирусов, имеется в виду их способность

трансформировать клетки in vitro - ими заражают клетки тех видов, которые они

трансформируют, но в которых не размножаются, а следовательно, и не вызывают

их лизис.

В состав группы паповавирусов, кроме вирусов полиомы и SV40, входит ряд

других вирусов. Свое наименование паповавирусы - группа получила от названий

трех вирусов: вируса кроличьей папилломы, вируса полиомы (по) и

вакуолизирующего (ва) обезъянеьего вируса, тип 40 (SV40). У человека эти

вирусы не вызывают заболеваний, хотя SV40 иногда заражает клетки человека. У

людей широко распространены три других паповавируса - вирус JC, ВК и вирус

бородавок. Предполагается, что вирус JC является этиологическим агентом

прогрессирующего дегенеративного заболевания центральной нервной системы

человека. Вирус ВК часто обнаруживают в моче лиц, принимавших

иммунадепрессанты, однако пока его не связывают с какой-либо патологией у

человека. Вирус бородавок человека, как и вирусы папиллом животных, вызывает

лишь доброкачественную пролиферацию эпидермиса.

Вирусы паполломы плохо размножаются в клеточных культурах, поэтому до сих

пор изучены в основном, лишь их физические свойства. Установлено, что их ДНК

несколько крупнее, чем ДНК вирусов SV40 и полиомы.

Аденовирусы

Хотя в вирионах аденовирусов содержится в 608 раз больше ДНК, чем в

паповавирусах, и геном аденовирусов кодирует соответственно большее число

белков, циклы репродукции этих вирусов в основном сходны. Так, у

аденовирусов, как и у паповавирусов, имеется механизм, контролирующий

переключение синтеза ранних макромолекул на синтез поздних, а их м РНК.

Также считываются с обеих цепей вирусной ДНК. Однако ДНК аденовирусов -

линейная молекула, и поэтому механизм ее репликации должен отличаться от

механизма репликации ДНК паповавирусов. В отличие от ДНК паповавирусов

частота рекомбинации ДНК аденовирусов достаточно велика, благодаря чему

последние можно изучать и методами формальной генетики.

Разнообразие аденовирусов

Аденовирусы выделены от самых разнообразных видов животных. Более того, от

каждого из этих видов выделено много различных аденовирусов. Так, среди

аденовирусов человека идентифицирован 31 серологический тип. Однако в

молекулярно-биологическом аспекте аденовирусы весьма сходны, поэтому при

дальнейшем обсуждении мы не будем проводить между ними различий. Аденовирусы

в основном вызывают острые респираторные заболевания; некоторые серотипы

аденовирусов человека при введении хомячкам вызывают у них опухоли. Почти

все штаммы аденовирусов способны вызывать трансформацию фибробластов крысы в

культуре, но ни один из этих вирусов не имеет отношения к злокачественным

опухолям у человека. Из сказанного ясно, что аденовирусы представляют

интерес и как инфекционные агенты, вызывающие респираторные заболевания у

человека, и как вирусы, способные вызывать опухоли, и как объекты

молекулярно-биологических исследований.

Вирионы аденовирусов отличаются изяществом структуры. В синтезе вирусных

частиц участвуют 14 видов белков, а быть может, и больше. В это число входят

и белки, из которых построены компоненты поверхности вириона - гексоны,

пентоны и фибриллы.

Герпесвирусы

Герпесивирусы, столь различные по характеру репродукции, но весьма сходные

морфологически и по содержанию ДНК, составляют часть биохимически гомогенной

группы. Наиболее детально изучены герпесвирусы, вызывающие лизис зараженных

клеток . К их числу относятся вирусы простого герпеса, типы 1 и 2 и ряд

быстро размножающихся герпесвирусов животных. Из вирусов этой группы, не

вызывающих лизиса, наиболее изучен вирус Эпштейна-Барр, вызывающий

инфекционный мононуклеоз - этот вирус постоянно выделяют из клеток двух

видов опухолей человека - лимфомы Беркитта и карциномы носоглотки. В

отличие от вирусов простого герпеса типов 1 и 2, размножающихся в культурах

многих клеток и вызывающих лизис, вирус Эпштейна-Барр заражает только В-

лимфоциты приматов и размножается не во всех из них.

ДНК герпесвирусов кодирует не менее 49 различных белков, для синтеза которых

используется почти вся кодирующая способность вирусного генома. Изучение

физиологии столь сложной системы - задача далеко не легкая.

Поксвирусы

У всех ДНК-содержащих вирусов, о которых речь шла выше, ДНК синтезируется в

ядре зараженной клетки, там же и созревают их вирионы. Все стадии размножения

поксвирусов происходят только в цитоплазме. Следовательно, репродукция

поксвирусов происходит в совершенно иных условиях по сравнению с «ядерными»

ДНК-содержащими вирусами. Известно большое разнообразие поксвирусов.

Наиболее важным из них для человека является вирус натуральной оспы. Однако

наиболее детально изучен вирус осповакцины и родственные ему вирусы

кроличьей оспы и коровьей оспы. Все поксвирусы имеют общий антиген.

Автономность размножения поксвирусов

Электронная микроскопия зараженных клеток показывает, что процесс

размножения поксвирусов ограничен цитоплазмой. Наиболее убедительно об этом

свидетельствует тот факт, что почти весь цикл размножения вирусов этой группы

может реализоваться в клетках, которые в результате воздействия на них

цитохалазина В лишены ядра. Заражение таких фрагментов приводит к синтезу в

них вирусной ДНК и многих вирусных белков: вирионы же в безъядерных клетках

не синтезируются. Следовательно, поксвирусы переносят центр функциональной

активности клетки из ядра в цитоплазму. Можно ожидать, что для этого вирус

должен обладать обширной специфической информацией, и поксвирусы

действительно такой информацией обладают, что выражается в числе кодируемых

и синтезируемых ими белков. В полном соответствии с этим является то, что

молекулярный вес ДНК таких вирусов больше, чем у любого другого вируса

животных, и что репродукция данного вируса связана с инициацией активности

самых разнообразных ферментов. Размножаясь в цитоплазме, поксвирусы во

многом ближе к РНК-вирусам, чем к «ядерным» ДНК-вирусам. И действительно,

подобно некоторым РНК-вирусам, размножение поксвирусов как таковое начинается

с транскрипции ДНК вириона РНК-полимеразой, содержащейся в самом вирионе,

вирион содержит все ферменты, необходимые для превращения РНК-

предшественника в функционально активные м РНК.

Ретровирусы

Ретровирусы обладают свойствами как РНК, так и ДНК-содержащих вирусов. В

вирионе ретровирусов содержится РНК, однако внутри клетки они существуют в

виде ДНК, интегрированной с геномом клетки-хозяина. По существу, РНК этих

вирусов, проникая в клетку, превращается в ее гены, которые могут

передаваться потомкам в виде стабильных интегрированных молекул ДНК. ДНК-

вирусов, которые наследовались бы подобным образом, не обнаружено, так как

все ДНК- содержащие вирусы вызывают продуктивную инфекцию и убивают клетки,

в которых они размножаются. Включаться в геном клетки-хозяина ДНК-содержащие

вирусы могут только в случаях «непродуктивных» вирусных инфекций.

Ретровирусы, напротив, размножаясь путем почкования, подобно многим другим

РНК- вирусам, поддерживают продуктивную инфекцию, не вызывая гибели клетки-

хозяина. Из сказанного ясно, что центральная проблема, без решения которой

нельзя понять механизм репродукции этих вирусов, состоит в том, каким

образом они превращаются из РНК-вирусов в ДНК-гены; этот процесс был назван

обратной транскрипцией, ибо здесь направление потока биологической

информации изменено на обратное.

Обнаружено много самых разнообразных ретровирусов. Некоторые из них способны

вызывать злокачественные опухоли. Лучше других изучены вирус саркомы Рауса и

вирусы, вызывающие лейкозы у кур и мышей. Из всех известных РНК-содержащих

вирусов злокачественные опухоли могут вызвать только ретровирусы. Именно

поэтому их принято называть общим термином «опухолеродные РНК-вирусы», хотя

многие ретровирусы не вызывают ни злокачественных, ни каких-либо иных

клинически выраженных заболеваний. Поэтому в единую классификационную

группу их объединяет лишь способ репродукции. Подобно другим группа вирусов,

различные виды ретровирусов также отличаются друг от друга по размеру и

морфологическим особенностям вирионов, числу белков, а также по кругу

чувствительных хозяев.

Влияние вирусной инфекции на клеточном уровне

Различают три вида воздействий, оказываемых вирусами животных на клетки.

Легче всего выявляется деструктивный, или цитолитический, эффект, для

которого характерно обширное повреждение множества различных клеточных

органелл. Вероятно, вирус - специфические макромолекулы вызывают первичное

повреждение, влекущее за собой цепь вторичных деструктивных процессов, в

которых участвуют уже продукты метаболизма самой клетки. На другом конце

спектра возможных последствий находится явление трансформации, когда

зараженная вирусом клетка приобретает способность к неограниченному

делению. По-видимому, это результат устойчивой интеграции вирусного генома

или его части с геномом клетки, которая не приводит к ее гибели.

Трансформированная клетка часто выходит из-под контроля механизмов,

регулирующих клеточное деление. Действие некоторых вирусов, геном которых не

включается в хромосомы клеток, занимает промежуточное положение между резко

выраженным деструктивным эффектом и трансформирующим действием. В этих

случаях зараженные клетки еще некоторое время функционируют и по меньшей

мере в одном случае - при заражении парамиксовирусами - продолжают расти и

делиться, одновременно продуцируя вирус («персистентная инфекция»). Возможна

еще одна категория реакции клеток, при которой можно говорить об индуктивном

действии вируса. Многие вирусы способны индуцировать образование в зараженной

клетке белков, кодируемых не вирусным, а клеточным геномом, но, по-

видимому, синтезируемых клетками в ответ на вирусную инфекцию. Этот тип

реакции не обязательно связан с тем или иным конечным результатом

взаимодействия вируса с клеткой.

Цитолическое действие вирусов: биохимические данные.

Зная, что многие вирусы вызывают резкие деструктивные изменения клеток-

хозяев, биохимики заинтересовались вопросом, прекращается ли при этом синтез

всех клеточных белков РНК и ДНК, и если да, то в какой последовательности.

Ответы сводятся к следующему:

1. Вероятно, различные вирусы подавляют синтез клеточных белков, используя

разные механизмы. Степень и время этого подавления тоже неодинаковы.

2. Нередко вирус блокирует накопление клеточной РНК, приостанавливая

процессинг пре-р РНК, но никак не влияя на ее синтез. Образование клеточной т

РНК часто не снижается. Во многих случаях бывает нарушен синтез клеточных м

РНК, но механизм этого нарушения совершенно неясен.

3. Нередко бывает подавлена инициация синтеза клеточной ДНК, однако при

некоторых вирусных инфекциях клетки, уже вошедшие в фазу S, могут завершить

цикл синтеза ДНК, а клетки, прошедшие через фазу S, могут пройти и через

митоз. Ингибирование синтеза клеточной ДНК- это вероятно, вторичное

следствие прекращение синтеза белка, так как синтез ДНК идет лишь в том

случае, если одновременно продолжается синтез белка.

Интерферон

Рассматривая здесь интерферон только как белок, синтезируемый клеткой в ответ

на вирусную инфекцию и придающий устойчивость к инфекции другим клеткам, это

значило бы игнорировать историю открытия интерферона и связь его с давно

известным явлением интерференции вирусов.

Уже давно было известно, что животное часто приобретает защиту от

вирулентного действия одного вируса в результате одновременного или

предшествующего заражения менее вирулентным штаммом того же вируса или

каким-либо другим, неродственным вирусом. Впервые это явление было

подвергнуто количественному анализу при изучении тормозящего действия

ненейротропных штаммов вируса гриппа на размножение нейратропного штамма.

Такое действие оказывает не только живой вирус: образование инфекционного

вируса гриппа в куриных эмбрионах вирусом гриппа, облученным ультрафиолетом.

Айзекс и Линдеман обнаружили, что аллантоисная жидкость куриных эмбрионов, в

которые был введен облученный вирус, тоже обладает интерферирующей

активностью. Вещество, ответственное за эту активность, было названо

интерфероном. Оно блокирует репродукцию самых различных РНК- и ДНК- вирусов

как в куриных эмбрионах, так и в культурах клеток. Интерферон образуется и в

организме многих животных. Это также синтезирует in vitro клетки самых

различных типов, как нормальные, так и злокачественные, хотя и в весьма

разных количествах. Особенно хорошими продуцентами интерферона могут

служить клетки Lмыши и специально выведенная линия фибробластов человека.

Большие количества интерферона вырабатывают также циркулирующее в крови

лейкоциты. Наконец, некоторые ткани, по-видимому, накапливают интерферон,

так как введение в организм различных неспецифических токсичных веществ,

например бактериального эндотоксина, быстро приводит к появлению в сыворотке

крови больших количеств вещества, тормозящего размножение вирусов - скорее

всего интерферона.

Одно время полагали, что интерфероны строго водоспецифичны, однако это

неверно. Например, интерфероны человека и обезьяны защищают от вирусов как

клетки человека, так и клетки обезьян, позднее было обнаружено, что это

относится и к интерферонам более далеких друг от друга видов, например

человека и различных грызунов. Однако эффективность гетерологичных

интерферонов сильно варьирует.

Степень защиты того или иного вируса определяется типом клеток, а не

интерферона. Интерферон человека защищает клетки человека от вируса

везикулярного стоматита лучше, чем от вируса леса Семлики, и такое же

соотношение наблюдается при защите клеток человека интерфероном обезьяны.

Напротив, клетки обезьяны получают большую защиту от второго из этих вирусов,

чем от первого, независимо от того, какой из двух интерферонов к ним

добавляют.

Интерферон - очень активный белок. Человеческий интерферон уже в концентрации 10

-11 М препятствует размножению вируса везикулярного стоматита в

фибробластах человека. Для сравнения напомним, что полипептидные гормоны,

например инсулин, глюкагон и другие, физиологически активны в концентрациях

от 5х10-10 до 1х10-8 М.

Даже без полной очистки интерферона можно продемонстрировать его

гетерогенность. Интерфероны, продуцируемые клетками одного вида, например

человека, могут защищать от вирусов клетки других, весьма отдаленных видов,

например кролика. Стюарт и Десмайтер определили молекулярный вес

интерферона человеческих лейкоцитов, защищавшего от вирусов клетки как

человека, так и кролика. В неочищенных препаратах они обнаружили два вида

активных молекул с мол. Весами около 21000 и 15000 соответственно. Активность

меньше молекул в отношении клеток человека оказалась в 20 раз большей, чем в

отношении клеток кролика, тогда как более крупные молекулы были в обоих

случаях одинаково активны. Кроме того, интерферон с мол. Весом 15000

полностью инактивировался под действием В-меркаптоэтанола, который разрывает

дисульфидные мостики, а активность интерферона с мол. Весом 21000 не

изменялась. Таким образом многие клетки (если не большинство их) продуцируют

два вида полипептидов, обладающих активностью интерферона. Индукция синтеза

интерферона и индукция интерфероном «противовирусного» состояния клетки -

два тесно связанных между собой, но, вероятно различных явления. Клетки,

приобретающие устойчивость к вирусам, могут продуцировать интерферон. Однако

за устойчивость клеток почти наверняка ответствен не сам интерферон, а

какой-то другой белок, ибо от момента добавления интерферона до полного

развития у них устойчивости к вирусам проходит много часов, и после этого

клетки могут и не продуцировать обнаружимых количеств интерферона. Тем не

менее добавление вируса к клеткам, защищенным с помощью интерферона, может

привести к дополнительной выработке интерферона этими клетками.

Индукция интерфероном устойчивости клеток к вирусам

Клетки в культуре in vitro , в которых синтез интерферона индуцирован убитым

вирусом или полинуклеотидами, также становятся устойчивыми к вирусам. Кроме

того, многие клетки, подвергшиеся воздействию интерферона, при заражении их

вирусом вырабатывают очень большие добавочные количества этого вещества.

Однако некоторые клетки обезьян хотя и становятся устойчивыми к вирусам после

воздействия интерферона обезьяны, не могут вырабатывать обнаружимых

количеств интерферона и не приобретают устойчивости к вирусам после

воздействия poly (е) poly (с) и других двухцепочечных РНК. Кроме того,

клетки этой линии в отличие от большинства других почечных клеток обезьян

после заражения их вирусом краснухи не становятся устойчивыми по многим

другим вирусам. Показано также , что в тех случаях, когда индукция

интерферона при помощи poly(е) poly (с) сочетается с добавлением к культуре

анти-интерфероновых антител, клетки не становятся устойчивыми к вирусной

инфекции.

Все этим данные позволяют предполагать, что для создания устойчивости к

вирусам нужно, чтобы на поверхности клетки оказались небольшие количества

интерферона. Возможно, что при индукции устойчивости с помощью poly (е)

poly (с) вначале образуется интерферон, а затем уже этот интерферон

индуцирует состояние устойчивости. Однако после того как это состояние

полностью сформировалось, образования клетками интерферона обнаружить не

удается и если не прибавляют снова интерферон, устойчивость исчезает.

Результаты ряда других экспериментов также подкрепляют гипотезу о том, что

интерферон индуцирует устойчивость клеток к вирусам, взаимодействуя с

клеточной мембраной.

Молекулярная основа устойчивости клеток к вирусам.

Хотя устойчивость, индуциорованная интерфероном, защищает клетки от самых

различных ДНК РНК-вирусов, степень защиты от разных вирусов неодинакова.

Кроме того, для достижения сходной степени защиты клеток одной и той же

культуры от различных вирусов нужны различные количества интерферона.

Миксовирусы, тогавирусы и вирус осповакцины, у которых имеется оболочка,

содержащая липиды, более чувствительны к действию интерферона, чем

аденовирусы и энтеровирусы. Однако ряд вирусов, обладающих оболочкой, в том

числе вирусы герпеса и ньюкаслской болезни, более устойчивы к интерферону.

Наиболее устойчивы мелкие РНК-содержание икосаэдрические вирусы. Интерферон

блокирует вирусную инфекцию после адсорбции вируса и проникновения его в

клетку. Поскольку интерферон может подавлять репликацию как РНК-, так и ДНК-

содержащих вирусов, логично предположить, что он ингибирует трансляцию

вирусных м РНК на рибосомах клетки - процесс, общий для всех вирусов. Такого

рода эффект мог бы реализоваться при участии противовирусного белка,

способного отличать клеточные м РНК от вирусных. Однако при изучении синтеза

белка в экстрактах клеток, обработанных интерфероном, не было получено

убедительных данных о том, что такие системы нормально транслируют

клеточные м РНК, но не транслируют вирусных м РНК. Таким образом, несмотря на

привлекательность простейшей гипотезы, объясняющей действие интерферона

избирательным подавлением трансляции вирусных м РНК, нужно признать, что ни

один простой механизм не согласуется со всеми известными данными об

устойчивости клеток к вирусной инфекции.

В клетках, подвергшихся действию интерферона, а затем зараженных вирусом

осповакцины, синтез «ранних» м РНК вирионной ДНК-зависимой РНК-полимеразой не

подавляется, но эти м РНК не транслируются и синтеза ранних вирусных белков

не происходит. При заражении клеток реовирусами большие количества

интерферона тоже лишь очень незначительно подавляют синтез вирусных м РНК и

намного сильнее ингибируют их трансляцию Однако ни в том, ни в другом случае

не было показано, что вирусные м РНК подвергались надлежащей модификации -

что к 3-концу присоединялась метилированная «шапочка» или (в случае вируса

осповакцины) к 3-концу добавлялась цепочка poly (А). Поэтому возможность,

что индуцированная устойчивость к вирусам связана не с изменением аппарата

трансляции, а с образованием неполноценных вирусных м РНК.

Интерференция вирусов без участия интерферона

Некоторые вирусные инфекции исключают возможность последующего размножения в

тех же клетках других неродственных, а в некоторых случаях и родственных

вирусов. Это явление было названо интерференцией. В отличие от действия

интерферона оно связано не с реакцией генома клетки на вирусную инфекцию, а

с тем, что первый вирус образует в клетке специфические продукты,

препятствующие размножению в той же клетке другого вируса. Было исследовано

множество парных сочетаний различных вирусов: вероятно, в большинстве случаев

интерференция обусловлена блокадой трансляции м РНК второго вируса. Однако в

некоторых случаях первый вирус блокирует способность второго надлежащим

образом проникать через плазматическую мембрану клетки.

Разнообразие возбудителей и вызываемых ими заболеваний

Ни одна из попыток построить простую систему классификации патогенных вирусов

пока не увенчалась успехом. Нет такого клинического синдрома, который мог

бы быть вызван вирусом только одного типа, и нет такой группы вирусов,

которая поражала бы только одну определенную ткань. Например, легко

протекающие заболевания верхних дыхательных путей могут быть вызваны

пикорнавирусами (риновирусами, вызывающими так называемые простудные

заболевания), аденовирусами, миксовирусами (вирусом гриппа) парамиксовирусами

(респираторно-синцитиальным вирусом) и, вероятно, другими, например

реовирусами, обладающими оболочкой, - короновирусами. Печень могут поражать

тогавирусы (например, вирус желтой лихорадки) и вирус гепатита (он, вероятно,

содержит ДНК и липиды). Заболевания нервной системы, приводящие к параличам

и смерти, могут вызвать тогавирусы )к этой группе относятся десятки различных

возбудителей энцефалита), рабдовирусы (например, вирус бешенства),

пикорнавирусы (вирус полиомиелита) и ряда других. К системным вирусным

болезням, сопровождающимся обильными кожными высыпаниями, относятся оспа -

едва ли не самая грозная из вирусных инфекций и такие распространенные и

легкие болезни, как корь, ветряная оспа, краснуха. Вирус оспы, который еще

недавно губил множество людей в развивающихся странах, является типичным

представителем группы поксвирусов.

Вирус кори - возбудитель быстро проходящего заболевания, при котором, однако

иногда поражается и центральная нервная система - относится к

парамиксовирусам, а вирус краснухи, обычно легкого заболевания,

проявляющегося в основном сыпью, - к тогавирусам. Болезнь, называемая

«ветряной оспой» на самом деле вызывается герпесвирусом, совсем не

родственным вирусу оспы. Этол в высшей степени контагиозный вирус, почти

неизменно вызывающий клинически явно выраженное заболевание.

Персистентные инфекции

Большинство упомянутых выше вирусных инфекций приводит к развитию

соответствующих симптомов в течение нескольких дней или максимум двух-трех

недель. Заболевания эти острые, т.е. начинаются они более или менее внезапно

и длятся определенное, достаточно короткое время. Однако во многих других

случаях вирусы весьма долго взаимодействуют с организмом животного или

человека. Различают следующие формы таких инфекций:

1) латентные инфекции, при которых содержащийся в организме вирус лишь время

от времени вызывает характерные поражения, вскоре исчезающие сами собой. Из

пораженных участков можно выделить вирус, но потом он становится «латентным»,

т.е. его уже выделить не удается.

2) хронические инфекции - длительно протекающие заболевания, при которых

вирус присутствует постоянно. Симптомы могут полностью отсутствовать или же

могут вызываться комплексами вирус-антитело либо взаимодействием

противовирусных антител с зараженными клетками, вероятнее всего с их

мембранами.

3) медленные инфекции - медленно прогрессирующие заразные заболевания с

исключительно длинным латентным периодом.

Иммунные реакции

Наиболее специфическая реакция на вирусную инфекцию - это, конечно, выработка

антител. Циркулирующие антитела, по-видимому, играют важную роль в

предупреждении некоторых вирусных инфекций. Например, как после заболеваний,

вызываемых многими вирусами, так и после вакцинации наблюдается длительный

иммунитет и в сыворотке крови выявляются специфические антитела.

Циркулирующие антитела при ряде вирусных инфекций, вероятно, служат барьером,

препятствующим распространению вируса по всему организму. На это указывает

тот факт, что при кори и свинке раннее введение глобулина блокирует

дальнейшее развитие болезни. Вероятно, при естественно протекающих

заболеваниях быстрое появление антител в крови может препятствовать

распространению вируса из первичного очага инфекций. После инъекции кроликам

вируса полиомиелита уже через 24 часа с помощью достаточно чувствительного

метода в сыворотке можно обнаружить антитела к этому вирусу. Поэтому вполне

возможно, что именно такие ранние антитела ответственны за тот факт, что у

человека размножение этого вируса в глотке и кишечнике в большинстве случаев

не ведет к его распространению по всему организму. Как полагают по той же

причине немедленная вакцинация укушенного больным животным человека защищает

его центральную нервную систему от поражения вирусом бешенства.

Опухолеродные вирусы

За годы, прошедшие с тех пор, как впервые был установлен факт возникновения

вирусных сарком у кур, многочисленными исследователями у разных видов

позвоночных были обнаружены онкогенные вирусы, принадлежащие к двум группам :

ДНК - содержащие и ретровирусы. Среди онкогенных ДНК-вирусов есть

паковавирусы, адековирусы и герпесвирусы. Из РНК-содержащих вирусов опухоли

вызывают только ретровирусы.

Диапазон опухолей, вызываемых онкогенными вирусами, необычайно широк. Хотя

вирус полиомы вызывает главным образом опухоли слюнных желез, уже само его

название показывает, что он способен вызывать и многие другие опухоли.

Ретровирусы вызывают главным образом лейкозы и саркомы, которые нередко

бывают причиной опухолей молочной железы и ряда других органов. Хотя рак -

это заболевание целого организма, аналогичное по сути явление, называемое

трансформацией, наблюдается и в культурах клеток. Такие системы используются

в качестве моделей для изучения онкогенных вирусов. Способность

трансформировать клетки in vitro лежит в основе методов количественного

определения многих онкогенных вирусов. Эти же системы используются и для

сравнительного изучения физиологии нормальных и опухолевых клеток.

Что такое трансформированная клетка ?

Один из способов получения популяции трансформированных клеток состоит в

заражении нормальных клеток онкогенным вирусом, например вирусом саркомы

Рауса или вирусом полиомы, и последующем выделении колоний измененных клеток.

Изменения могут касаться морфологии клеток (например, их округление) и

характера роста (“наползание” клеток друг на друга в отличие от нормального

роста в виде однослойной культуры или приобретение способности размножаться в

полужидкой среде, в которой нормальные клетки не размножаются).

Существуют и иные критерии отбора трансформированных клеток. Как правило,

клетки отобранные по одному из критериев, удовлетворяют и большинству других.

Способностью трансформировать клетки in vitro обладает большинство онкогенных

ДНК-вирусов и вызывающих саркомы ретровирусов. Ретровирусы, вызывающие

лейкозы, напротив, размножаются в клетках, не вызывая их трансформации.

Получив культуру клеток, признанных трансформированными по одному из

упомянутых критериев, следует сопоставить их с нормальными клетками по ряду

других параметров. Во многих книгах такого рода перечислены те изменения

свойств клеток, которые происходят в процессе трансформации. Известны две

большие группы изменений :

1) изменения регуляции роста и продолжительности жизни, и

2) изменения клеточной поверхности (плазматической мембраны).

Изменения свойств клеток, определяющие рост и размножение.

Большинство нормальных клеток, размножаясь, прикрепляются к субстрату (к

стеклянной или пластмассовой стенке сосуда). Нормальные клетки перестают

делиться еще до истощения питательной Среды. Они остаются прикрепленными к

субстрату жизнеспособными покоящимися клетками. Если такие клетки снять с

субстрата и поместить в условия пониженной плотности популяции, они начнут

снова делиться. На первый взгляд кажется, что клетки нормальной культуры,

рост которой прекратился, располагаются в виде монослоя. Однако на самом деле

в таких культурах не перекрываются лишь наиболее заметные части клеток - их

ядро, тогда как цитоплазма, напротив, перекрывается на весьма значительной

площади ; тем не менее такие культуры принято называть однослойными.

В отличие от нормальных большинство трансформированных клеток не переходят в

стадию покоя, а продолжают непрерывно делиться. Это, по-видимому, наиболее

характерная особенность трансформированных клеток. Непрерывно делящиеся

клетки не реагируют на контакт с соседними клетками : натолкнувшись на своем

пути на другую клетку, они не прекращают свое деления : растут они

хаотически, подползая под другие клетки или наползая на них, в результате

чего и образуются многослойные бесформенные массы.

Трансформированные клетки действительно выглядят злокачественными по

сравнению с нормальными. Из сопоставления беспорядочной организации

трансформированных клеток со строго упорядоченной организацией нормальных

создается впечатление, что нормальная клетка “ощущает” момент контакта с

соседней, что и приводит к остановке деления ; трансформированные же клетки

не обладают таким “сесорным” механизмом и поэтому растут, наползая друг на

друга. Методом замедленной киносъемки было показано, что в “разреженной”

нормальной культуре при встрече двух клеток происходит остановка одной из них

или обеих, а затем их движение продолжается, но в другом направлении. Этот

хорошо изученный феномен известен как контактное торможение. В культуре

трансформированных клеток этого не наблюдается. Именно благодаря контактному

торможению культуры нормальных клеток представляют собой упорядоченные

однослойные системы.

Более вероятно, что критическим фактором является не контакт с соседними

клетками, а нехватка каких-то лимитирующих фаторов, необходимых для

размножения. Полагают: что роль таких факторов играют вещества, содержащиеся

в сыворотке крови, прибавление которой к культуре поддерживает клеточное

деление. Установлено, что оптимальная концентрация сыворотки для размножения

трансформированных клеток значительно меньше, чем для размножения нормальных

клеток. Для понимания сущности трансформации очень важен следующий факт.

Подавляющее большинство нормальных клеток размножается лишь при условии

прикрепления к плотному субстрату. Трансформированные клетки, напротив,

размножаются и образуют колонии и в отсутствие такой опоры, например будучи

суспендированы в геле-агаровом метилцеллюлозном. Этим свойством пользуются

для непосредственного отбора трансформированных клеток. Согласно данному

методу, из популяции нормальных клеток, зараженных трансформирующим вирусом,

отбирают отдельные клетки и высеевают в среду с агаром. выросшие в данной

среде колонии состоят из трансформированных клеток.

Изменения свойств поверхности.

Заражение клеток трансформирующими вирусами приводит не только к упомянутым

выше изменениям их морфологии и способности к размножению, но и к резко

выраженным биохимическим и биофизическим изменениям их строения и функций. До

сих пор объектом большинства таких исследований была плазматическая мембрана,

ибо не исключена возможность, что в основе трансформации клеток лежат

изменения строения и свойств именно их плазматической мембраны, хотя не менее

существенные изменения происходят и в других системах. К числу первых

изменений, наблюдаемых в таких клетках, относятся изменения их функций, и в

частности усиление транспорта сахара.

Другое изменение - повышение аглютинабельности клеток под действием лектиков,

например конканавалика А. Лектины - это природные вещества растительного

происхождения, поливалентные макромолекулы которых специфически связывают

определенные углеводы. Образуя поперечные связи между молекулами

гликопротеидов клеточной поверхности, они вызывают агглютинацию клеток. Почти

все опухолевые клетки значительно легче агглютинируются под действием

лектинов, чем их нормальные предшественники. Плазматические мембраны

нормальных и трансформированных клеток отличаются друг от друга по целому

ряду свойств. Так, в плазматической мембране трасформированных клеток

повышено содержание гиалуроновой кислоты и связанной с белками сиаловой

кислоты, а содержание ганглиозидов, напротив, понижено. Так называемый LETS-

белок (с мол.весом 250 000), в норме один из главных белков плазматической

мембраны, в трансформированных клетках отсутствует. Поверхность

трансформированных клеток также более гофрирована, чем у нормальных клеток.

Еще одним результатом трансформации клетки является повышение подвижности

поверхностных белков, связывающих конкавалин А.

Сшивание белков плазматической мембраны под действием этого лектика приводит

к их слиянию с образованием агрегатов - “пятен”. При одной и той же

концентрации конкавалина образование пятен у трансформированных клеток

значительно усилено по сравнению с нормальными. Повышенная подвижность

поверхностных белков, по всей вероятности, обусловлена разрушением

цитоскелета, а не изменением микровязкости липидов. Повышенной подвижностью

поверхностных белков, возможно, объясняется большая склонность опухолевых

клеток (по сравнению с нормальными) к аглютинации под действием лектинов.

Агрегаты лектин - рецептор на поверхности трансформированных клеток служат

местами формирования прочных связей между клетками ; на поверхности

нормальных клеток лектины реагируют с рецепторами не столь эффективно, и

потому межклеточные связи не столь прочны.

Одно из важных свойств опухолевых клеток - их инвазивность.

Трансформированным клеткам также присуща инвазивность, о чем свидетельствует

способность их проникать сквозь хориоллантоисную мембрану куриного эмбриона.

Ни клетки первичных культур, ни клетки стабильных линий не обладают такой

способностью. Возможно, что способность к инвазии является следствием

вызванных вирусом изменений плазматической мембраны и (или) способности

клеток выделять протеазы во внеклеточную среду. Различия между нормальными и

трансформированными клетками далеко не исчерпываются различиями в свойствах

их плазматических мембран. Так, заражение куриного эмбриона вирусом саркомы

Рауса ведет к транскрипции генов, кодирующих синтез фетального гемоглобина, -

факт прямого влияния трансформации на функцию генов. Пожалуй, правильнее

всего будет предположить, что трансформацию клетки вызывают продукты вирусных

генов, которые действуют как общие депрессоры, включающие транскрипцию

обширных областей клетки. Именно эти деприссированные белки в конечном счете

и ответственны за способность трансформированных клеток непрерывно

размножаться в тех условиях, в которых деление нормальных клеток

прекращается.

Вирусная генетическая информация в трансформированных клетках.

Все трансформированные вирусом клетки содержат его генетический материал. За

исключением ДНК вируса ЭБ, который поддерживается в трансформированных им

лимфоцитах в виде плазмиды, вирусная ДНК ковалентно интегрирована с ДНК

клетки - хозяина. Что касается ретровирусов, то интеграция провируса с

геномом клетки вообще является естественной стадией их репродуктивного цикла.

В отношении ДНК опухолевых вирусов, напротив, нет данных об обязательном

участии интеграции в их литическом цикле, хотя при продуктивной инфекции в

таких зараженных клетках обнаружены нуклеотидные последовательности,

состоящие из фрагментов вирусной и клеточной ДНК.

Наиболее убедительные доказательства линейной интеграции вирусной и клеточной

ДНК представили Ботган и др. Эти исследователи расщепляли рестрикционными

пидонуклеазами ДНК клеток, трансформированных вирусом SV 40, и получали

фрагменты, которые содержали среди клеточных нуклеотидных последовательностей

полные интегрированные с ними геномы вируса. Эти авторы установили также

последовательность расположения в геноме вируса выделенных фрагментов ДНК. В

результате было обнаружено, что в каждой из исследованных клеточных линий

кольцевая ДНК вируса расщеплялась в разных точках и встраивалась в разные

Страницы: 1, 2, 3, 4