Диплом: Состояние естественной резистентности и иммунологической реактивности у новорожденных телят при колибактериозе

из которого изготовили люминисцируюшие лактоглобулины для диагностики

паратифа телят и экспресс-индикации бруцелл [В. А. Атамась, 1968; В. А.

Атамась, 1969].

Из сыворотки молозива коров, иммунизированных внутривыменно против

диплококковой септицемии, получен специфический лактоглобулин и испытан с

профилактической и лечебной целью в опытах на телятах. Противодиплококковый

лактоглобулин обладал довольно выраженными профилактическими и лечебными

свойствами [В. В. Май, 1970].

В ФРГ широко применяют гамма-глобулиновые препараты для профилактики и

лечения колибактериоза и налажено промышленное производство гамма-

глобулиновых препаратов из сыворотки убойных животных, сыворотки

иммунизированных животных и молозива [R. Kruedener, 1970].

Из молока коров, гипериммунизированных внутривыменно модифицированным штаммом

БУК вируса болезни Ауески получен иммунолактон против болезни Ауески [Д. Ф.

Осидзе, В. К. Муравьев, В. Т. Ночевный, В. П. Онуфриев, В. М. Кравченко,

1972]. Авторы на основании проведенных исследований, установили

принципиальную возможность диателической иммунизации коров штаммом БУК вируса

болезни Ауески с целью получения специфической лактосыворотки и

иммунолактона. Препарат в дозе 0,5-2,0 г/кг массы тела животного обладал

выраженным профилактическим действием. Пассивный иммунитет у животных

сохранялся 21 день. Лечебный эффект отмечали только после применения

иммунолактона в первые двое суток после инфицирования животных.

Путем осаждения сернокислым аммонием молозивной сыворотки, был получен

специфический лактоглобулин который обладал профилактическими и лечебными

свойствами при экспериментальном и спонтанном заражении телят колибактериозом

[Н. С. Жосан, 1974; Н. С. Жосан, 1976].

Для получения лактоглобулина [Е. В. Гублер, А. А. Генкин, 1978] использовали

молозиво первого и второго удоев после отела коров. Молозиво подогревали до

температуры 38-40° С, затем к нему добавляли свежеприготовленный раствор

пепсина из расчета 100 мл на 900 мл молозива. После отделения молозивной

сыворотки ее фильтровали через 4-5 слоев марли, затем через бумажный фильтр и

консервировали 5 %-ным раствором фенола в 0,5 %-ном отношении к ее объему.

Добавляли его при постоянном помешивании из расчета 11,1 мл на 100 мл

препарата. Выпаивали лактоглобулин телятам в подогретом виде (38° С) в дозе

100-120 мл, первый раз за 30 мин до кормления молозивом, второй к концу

первых суток. Больным животным после голодной диеты (8-9 ч) его давали утром

до кормления один раз в сутки 2-3 дня в такой же дозе.

Из сыворотки крови отелившихся коров, находившихся в родильном отделении не

менее 10 дней В. П. Павлов, Т. Н. Грязнева, Е. В. Чичикова, 1988, изготовили

гаммаглобулин. Кровь брали у клинически здоровых животных (до 2 л от

каждого). Из сыворотки крови готовили гаммаглобулин, используя 3 %-ный

раствор этакридина лактата. Новорожденным телятам через каждые 3 дня

инъецировали специфический гаммаглобулин внутримышечно в дозе 1 мл/кг массы

тела, декстрофан и тривит в дозах соответственно 5 мл и 2 мл внутримышечно, а

также в течение трех суток 2 раза в день внутримышечно вводили гентамицин в

дозе 1,5 мг/кг массы, что позволило профилактировать желудочно-кишечные

болезни у 100 % животных.

Для коррекции иммунодефицита неонатальных телят использовали колостральную

сыворотку и лактоглобулин. [Н. С. Жосан, 1992]. Препараты вводили

внутримышечно или подкожно, в дозе по 0,5 мл на кг живой массы дважды с

интервалом 24 ч. Данные препараты повышали естественную резистентность

организма, содержали неспецифические антитела против энтеропатогенов

циркулирующих, в каждом конкретном хозяйстве при условии изготовления

колостральной сыворотки и лактоглобулина, из молозива, полученного от коров

данного хозяйства.

Применение молозива и его производных (молозивный иммуногормональный

препарат, молозивная сыворотка, гидролизат казеина) снижает заболеваемость

телят диареей на 50-60%, при этом болезнь протекает в легкой форме со 100%

выздоровлением. Парентеральное введение этих препаратов новорожденным телятам

способствует повышению уровня белка в сыворотке крови в 1,5 раза,

иммуноглобулинов в 2 раза, уровень лейкоцивот у этих животных не превышал

8000, бактериальная загрязненность фекалий была в 2-3 раза ниже, чем у телят,

которым молозиво давали только внутрь. Максимальный лечебно-профилактический

эффект молозивная терапия дает в том хозяйстве, где молозиво было получено

[В. В. Бурсуков, 1993; С. В. Вальциферова, 1997].

Исходя из литературных данных, следует отметить, что иммунное молозиво,

молоко и полученные из них препараты обладают выраженными профилактическими

лечебными свойствами.

Сравнительная дешевизна сырья, используемого для получения препаратов из

молозива (практически оно не используется в хозяйствах) [М. Х. Шайхаманов, В.

П. Грамолин, Б. М. Авакаянц, 1993], простота изготовления, высокая

эффективность послужит основанием для получения указанных препаратов в

производственных условиях.

заключение

Анализируя данные литературы, касающиеся состояния естественной

резистентности и иммунологической реактивности у новорожденных телят при

колибактериозе, необходимо выделить следующие основные моменты:

· колибактериоз занимает среди заболеваний новорожденных животных

одно из ведущих мест и наносит значительный экономический ущерб;

· высокий уровень резистентности обеспечивает широкий диапазон

ответных реакций организма на влияние различных факторов внешней среды в том

числе и микроорганизмов, позволяющих ему адаптироваться на уровне

физиологической реактивности;

· животные с низким уровнем неспецифической резистентности не

способны адаптироваться к изменившимся условиям внешней среды, что часто

вызывает истощение резервной защитно-приспособительной реактивности и, как

следствие этого, приводит к гибели животных;

· сущность защитных факторов против колибактериоза телят

ассоциируется с лактоглобулиновой фракцией и уровнем К-антител-агглютининов в

сыворотке молозива коров и в сыворотке крови новорожденных телят;

· фагоцитирующие лейкоциты, лизоцим, комплемент, пропердин и

иммуноглобулины обладают функцией антител, противомикробное действие которых

в совокупности выражается бактерицидной активностью сыворотки крови;

· уровень иммуноглобулинов является одним из важных показателей

резистентности организма новорожденного. При этом следует определять и

учитывать иммунный статус до первой выпойки молозива и после его

скармливания;

· абсорбция колостральных иммуноглобулинов находится в прямой

зависимости от ряда факторов важнейшими из которых являются: способность

новорожденных телят усваивать их из молозива, условия внешней среды, качество

молозива и своевременная выпойка первого молозива в адекватном количестве;

· лактоглобулин совместно с ретинолом отличаются высоким иммуно-

корректирующим эффектом и широтой профилактического действия;

· аминазин совместно с Т-активином обладают иммуно-корректирующим

действием и антисекреторной активностью ингибирующей трансформацию

аденозинтрифосфата (АТФ) в циклический 3,5-аденозинмонофосфат (АМФ).

РАЗДЕЛ 2

РЕЗУЛЬТАТЫ

СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Материалы и методы исследований.

2.1.1.Общая методика. Экспериментальная часть работы выполнялась на ферме

крупного рогатого скота учебно-опытного хозяйства «Кетросу», района Анений Ной,

ОПХ «Колоница» района Криулень и в лаборатории микробиологии кафедры

эпизоотологии Государственного aграрного университета Молдовы с 1973 по 1998

год.

Опыты проводились на коровах черно-пестрой породы 5-8 лактации и на

родившихся от них телят, с целью изучения состояния неспецифической и

специфической иммунологической реактивности новорожденных телят при

колибактериозе, а также выявления роли кислотно-основного баланса в течение

инфекционного процесса, коррекции иммунодефицитного состояния новорожденных

телят. Для лечения применяли антисекреторные препараты, ингибирующие

циклический аденозинмонофосфат.

Пробы молозива отбирались в первый день (из первого, второго и третьего

доения), на второй, пятый день после отела, а на десятый, двадцатый день и

через месяц исследовалось молоко.

В сыворотке крови, молозиве и молоке изучались: динамика накопления

агглютининов, иммуноглобулиновый уровень, в т. ч. в динамике.

Сыворотку крови получали путем отстаивания, а из молозива — методом

пепсинизации. Из сывороток молозива первого и второго дня после отела

выделяли колостральную сыворотку и лактоглобулин. У родившихся телят от

опытных и контрольных групп коров в сыворотке крови изучали: динамику

накопления О- и К- антител-агглютининов, уровень иммуноглобулинов в

зависимости от клинического статуса, показатели фагоцитоза, пропердина,

комплиментарной и бактерицидной активности (до поения молозивом, на 2, 5, 10,

20 и 30 день жизни).

Бактерицидные свойства колостральной сыворотки и сыворотки крови

новорожденных телят изучали нефелометрическим методом. Профилактические и

лечебные свойства молозивных сывороток и лактоглобулина изучались на

лабораторных животных и телятах.

Коррекцию иммунодефицита неонатальных телят, проводили с применением

лактоглобулина и витамина А.

В качестве анти-секреторных факторов, ингибирующих циклический

аденозинмонофосфат (сАМР) применяли хлорпромазин и Т-активин.

Опыты проводились на 562 телятах, 468 коровах, 247 белых мышах и 30 кроликах.

Полученный цифровой материал подвергался биометрической обработке по

различным биометрическим методикам: [Дж. У. Снедекор, 1961; И. П. Ашмарин, А.

А. Воробьев, 1962; В. Ю. Урбах, 1964; Е. В. Гублер, А. А. Генкин А. А.,

1969].

2.1.2. Приготовление колибактериозного антигена. Для приготовления

антигена использовали три серотипа колибактерий: О78:К80, О119:К69 и О137:К79.

Использованные серотипы Е. coli по морфологическим и

биохимическим свойствам были типичными, отвечающими требуемым иммуногенным,

антигенным н вирулентным свойствам.

Е. coli О78:К80, О119:К69 и О137:К79 раздельно высевали в пробирки

с мясопептонным бульоном на 12 ч и проверяли на чистоту (микроскопия мазков,

окрашенных по Граму). В последующем бульонную культуру высевали на стерильный

мясопептонный агар в матрацах. Посевы выращивали в термостате в течение 18 ч

при температуре 37° С, проверяли на чистоту и смывали стерильным изотоническим

раствором хлорида натрия. Для выделения О-антигена бактериальную суспензию

автоклавировали при 120°С в течение 2 ч дня разрушения К-антигена. Густую

отмытую суспензию Е. coli содержащую 10 млрд. микробных тел в 1

мл по оптическому стандарту, смешивали с ацетоном в отношении 1:5 до появления

коагуляции (свертывания). Плотную часть материала отбирали на воронке Бюхнера,

промытой один раз ацетоном и затем высушенной эфиром. Препарат высушивали на

воздухе и хранили при 4°С.

Сухой порошок применяли для приготовления суспензии антигена, добавляя 1 мг

высушенных ацетоном бактерий на 1 мл барбиталового буфера.

Для выделения К-антигена бактериальную суспензию получали путем смыва из

агаровых культур изотоническим раствором хлорида натрия, содержащего 0,5 %

формальдегида. Бактерии были экстрагированы при добавлении ацетона

непосредственно после их смыва с агаровой культуры и промыты. [E. Neter, E.

A. Gorzynski, R. M. Gino, O. Westphal and O. Luderwitz. 1956; E. Neter,

1957].

Полученные О- и К-антигены проверяли на стерильность и на безвредность.

Стерильность устанавливали путем высева на МПБ, МППБ и МПА. Посевы

выдерживали 10 дней в термостате (+37°С). Безвредность антигенов была

проверена на лабораторных животных. Для этого каждый из антигенов вводили 10

белым мышам под кожу в области спины по 0,5 мл и 5 морским свинкам в области

внутренней поверхности задней конечности по 1,0 мл. Клинические наблюдения за

опытными животными вели в течение 15 дней.

Отсутствие роста в посевах на МПБ, МППБ и МПА и гибели привитых животных

позвонило считать антигены стерильными и безвредными. Хранились антигены при

температуре +4 +5°С в холодильнике.

2.1.3. Изучение агглютиногенных свойств серотипов О78:К80, О119:К69 и

О137:К79 Е. coli. Для определения агглютиногенности изучаемых

серотипов использовали 30 кроликов, по 5 на каждый серотип (определение О- и

К-антигенов). Антигены вводили кроликам в краевую вену уха в нарастающих дозах

(от 0,5 до 2,0 мл) с интервалом в три дня, четырехкратно.

Для определения О-антигена смешивали одну каплю антигена с одной каплей

соответствующей О-сыворотки на зеркальном стекле, размещали над водяной баней

при 60°С. Результаты учитывали через 10 мин после смешивания.

Позитивную реакцию подтверждали пробирочной агглютинацией, применяя

формалинизировавную шестичасовую культуру в МПБ. Основное разведение

сыворотки 1:10.

Для определения К-антигена культуру вначале тестировали пластинчатой реакцией

агглютинации на предметном стекле. Одну каплю живой суспензии культуры

смешивали с одной каплей различных антисывороток. Результаты учитывали в

течение 30с после смешивания. Позитивную реакцию подтверждали пробирочной

агглютинацией до титра тест сыворотки, применяя как антиген живую пятичасовую

культуру в МПБ. Пробирки инкубировали при 37°С два часа, в последующем

агглютинационные пробирки центрифугировали при 2000 об/мин в течение трех

минут. Одинаковый писк агглютинации учитывали как позитивную реакцию. [E.

Neter, E. A. Gorzynski, R. M. Gino, O. Westphal and O. Luderwitz. 1956; E.

Neter, 1957].

2.1.4. Получение сыворотки крови, молозива и молока. Кровь от животных

(коров, телят) брали из яремной вены в стерильные пробирки и помещали в

термостат (+37°С) на 3 ч, после чего выдерживали 12-16 ч при комнатной

температуре до полного отделения сыворотки. Затем сыворотку отсасывали в

стерильные пробирки и помещали в холодильник (+4 +5°С).

Молозиво от коров брали при первом, втором и третьем доении после отела, а

затем на второй, пятый, десятый, двадцатый дни и через месяц.

Сыворотку из молозива и молока получали путем добавления пепсина. На каждые

1000 мл молозива или молока добавляли 100 мл 0,5% раствора пепсина и после

тщательного перемешивания смесь помещали в водяную баню при температуре 38° С

на четыре часа. Образовавшийся сгусток, отделяли от сыворотки фильтрацией

через три слоя марли. Полученную сыворотку пропускам через воронку Бюхнера с

двойным слоем бедой фильтровальной бумаги, а затем через бактериальный фильтр

Зейтца.

2.1.5. Реакция атглютинации с молозивной и молочной сыворотками. В

центрифужные пробирки наливали 5-6 капель 5 % раствора пепсина, приготовленного

на изотоническом растворе хлорида натрия и 10 мл исследуемого молозива или

молока, тщательно перемешивали и для свертывания ставили в термостат при

температуре 38°С на 30 мин. Свернувшееся молозиво отделяли от стенок пробирки

стеклянной палочкой и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 мин.

С полученной сывороткой ставили реакцию агглютинации в объеме 1 мл в

разведениях с физиологическим раствором от 1:10 до предельного титра

сыворотки. Контроли обычные.

Антиген добавляли по 0,05 мл в каждую пробирку, пробы встряхивали и помешали

в термостат при температуре 37°С на 4 ч, после чего производили

предварительный учет реакции, а окончательный учет реакции определяли через

24 ч. Молозиво исследовали в день его получения.

2.1.6. Определение титра агглютининов. Для изучения динамики накопления

агглютининов в сыворотках крови и молозива использовали реакцию агглютинации,

которую ставили в объеме 1 мл (классическим методом) в пробирках с ровным

округлым дном с убитыми и живыми О- и К-антигенами (серотипы О78:К80; О119:К69;

О137:К79 Е. coli ).

Для определения агглютинационных титров, в наших исследованиях применяли

двукратное разведение сывороток. Разведение сывороток крови и молозива

производили в агглютинационных пробирках начиная с разведения 1:10.

После добавления антигена (по 0,05 мл) содержимое пробирок встряхивали, затем

помещали в термостат на 4 ч при температуре 37°С. После этого производили

предварительный учет результатов реакции. В дальнейшем пробирки выдерживали

24 ч при комнатной температуре и определяли окончательный результат.

Для учета результатов реакции агглютинации пользовались четырех крестовой

системой обозначения. За агглютинационный титр принимали то наибольшее

разведение сывороток, при котором еще наблюдалась видимая агглютинация,

оцениваемая в четыре креста.

2.1.7. Определение активности лизоцима в сыворотке крови. Сыворотку

крови, отделяли общепринятым методом. Предварительно готовили 1/15М фосфатный

буфер (рН 6,2), для чего использовали два исходных раствора: 4,539 г х. ч. КН

2РО4 растворенный в 500 мл дистиллированной воды и 2,375 г х.

ч. Nа2НРО4×12Н2O, растворенный в 200 мл

дистиллированной воды. При смешивании этих растворов в определенном

соотношении, получали рН буфера 6,2.

Для приготовления 1 % агара «Дифко» на 1/15М фосфатном буфере брали 1 г

сухого агара, помещали в колбу на 200 мл и заливали 99 мл 1/15М фосфатного

буфера. Колбу закрывали ватно-марлевой пробкой, помещали в кипящую баню и

выдерживали 25-30 мин.

Расплавленный агар охлаждали до 60-70°С и вносили в него ацетоновый порошок

Micrococcus lysodeikticus из расчета 10-20 мг на 100 мл объема.

Необходимое количество порошка перед внесением в агар суспендировали в 3-5 мл

1/15М фосфатного буфера. Полученную смесь перемешивали до получения однородной

взвеси.

Полученную смесь разливали в чашки Петри с таким расчетом, чтобы подучить

толщину слоя 4 мм.

После застывания агара в нем при помощи тонкостенной трубочки вырезали лунки

диаметром 5 мм на расстоянии 2-3 см от краев чашки и друг от друга. Для

подсыхания лунок чашки помещали в термостат приоткрытыми на 60 мин.

Исследуемые пробы сыворотки крови разводили соответственно 1/15М фосфатным

буфером 1:10, 1:2 и 1:5. Каждую пробу после разведения заливали в отдельную

лунку в объеме 0,05 мл.

Параллельно с исследуемым материалом 1/15М фосфатным буфером разводили

стандартный кристаллический лизоцим так, чтобы получить его растворы с

концентрацией 0,5 мкг/мл, 1; 3; 5; 10; 20; 40; 60; 80 и 100 мкг/мл. По 0,05

каждого разведения стандартного лизоцима разливали по отдельным лункам.

Чашки Петри с исследуемым материалом и стандартным лизоцимом выдерживали 48 ч

во влажной камере при комнатной температуре (22-24°С).

После экспозиции при помощи линейки измеряли диаметр зон лизиса

Micrococcus lysodeikticus вокруг лунок с исследуемым материалом и

стандартным лизоцимом.

Первоначально на полулогарифмической бумаге строили калибровочную кривую,

используя результаты, полученные при измерении зон лизиса вокруг лунок с

раствором стандартного лизоцима в различных концентрациях. Для этого

значения, отражающих диаметры зон лизиса субстрата в миллиметрах, откладывали

по оси абсцисс, а показатели концентрации стандартного лизоцима в мкг/мл,

вызывающих лизис по оси ординат. Точки пересечения первых и вторых значений

соединяли между собой, при этом получалась прямая линия.

Расчет результатов проводили следующим образом. Диаметр зоны лизиса

Micrococcus lysodeikticus вокруг лунки с сывороткой крови составил 9,5

мм. На калибровочном графике этому значению соответствовала концентрация 2,5

мкг/мл стандартного лизоцима. Сыворотку крови перед исследованием разводили

1:10 1/15М фосфатным буфером. Следовательно, концентрация лизоцима в

исследуемой пробе сыворотки крови равнялась 2,5×10=25 мкг/мл. Так как,

литическая активность стандартного лизоцима изменяется в результате

изготовления и хранения, полученное абсолютное значение выражали в единицах

относительной активности. Активность стандартного лизоцима составляла 20600

ед/мг или 20,6 ед/мк, активность лизоцима исследуемой пробы сыворотки молозива

равнялась 20,6×25 =515,0 ед/мл.

2.1.8. Определение содержания комплемента в сыворотке крови.

Исследовали сыворотку крови, полученную из яремной вены животных. Предварительно

готовили веронал-мединаловый буфер: 0,575 г веронала растворяли в 50 мл

дистиллированной воды, подогретой до 60° С, охлаждали и добавляли 8,5 г хлорида

натрия, 0,375 г мединала, 0,5 мл раствора содержащего 1 М MgCl2 и

0,3 М CaCl2 (100 мл Н2О + 19 г MgCl2×6Н

2О г + 6 г CaCl2). Объем доводили до 200 мл дистиллированной

водой. Буфер хранили в холодильнике. Перед употреблением буфер разводили

дистиллированной водой (1:4). Физиологический раствор: 8,5 г хлорида натрия

растворяли в 1 л дистиллированной воды и фильтровали.

Эритроциты барана. Кровь у барана брали из яремной вены в колбу с бусами

и встряхивали в течение 10-15 мин для предотвращения свертывания.

Дефибринированную кровь фильтровали через двойной слой марли. Эритроциты барана

отмывали 3 раза центрифугированием по 10 мин при 3000 об/мин. Из отмытых

эритроцитов готовили 5 % взвесь на физиологическом растворе и стандартизовали

на ФЭК. С этой целью эритроциты лизировали: к 1 мл отмытых эритроцитов

добавляли 9 мл дистиллированной воды. Лизированные эритроциты

фотоколориметрировали при зеленом светофильтре против воды. Оптическая

плотность лизата — 1,08 при длине 541 мкм в кювете 10 мм.

Для определения титра гемолизина, готовили вначале основное разведение

гемолитической сыворотки 1:100 (0,1 мл сыворотки + 9,9 мл буфера), затем из

этого разведения поучали разведения от 1:1000 до 1:4000.

	1:1000	1:1200	1:1500	1:2000	1:2500	1:3000	1:3500	1:4000
Буфер, мл	0,9	1,1	1. 4	1,9	2,4	2,9	3,4	3,9
Гемолизин	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1

Гемолитическую систему готовили следующим образом. К стандартизованной 5 %

взвеси эритроцитов барана медленно, при постоянном помешивании, добавляли

равный объем гемолизина в тройном титре. Так, если полный гемолиз наблюдался

в пробирке с разведением гемолитической сыворотки 1:1200, то для

приготовления гемолитической системы брали разведение 1:400 (0,1 мл цельной

гемолитической сыворотки и 39,9 мл буфера). Пробирки с гемолитической

системой встряхивали и инкубировали при 37° С в течение 1ч для сенсибилизации

эритроцитов барана.

Исследуемую сыворотку, разводили 1:10, разливали в 10 пробирок и доводили

буферным раствором (физиологическим) до 1,0 мл. После этого в каждую пробирку

добавляли 1 мл гемолитической системы, то есть сенсибилизированных

эритроцитов барана, 2-я пробирка — контрольная.

Исследуемая сыворотка (1:10), мл	0,05	0,1	0,15	0,2	0,25	0,3	0,35	0,4	0,45	0,5
Буферный раствор	0,95	0,9	0,85	0,8	0,75	0,7	0,65	0,6	0,55	0,5
Сенсибилизированные эритроциты барана	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0

Пробирки инкубировали при 37° С в течение 45 мин, охлаждали в холодильнике 10

мин, центрифугировали при 1500 об/мин и колориметрировали на ФЭК в кюветах

(10мм) с зеленым светофильтром против воды и определяли процент гемолиза.

Для определения активности комплимента в гемолитических единицах готовили

шкалу и кривую гемолиза. Для приготовления шкалы гемолиза к 1 мл стандартной

5 % взвеси эритроцитов барана прибавляли 3 мл дистиллированной воды в

результате чего происходил гипотонический лизис эритроцитов (100 % гемолиз).

Пробирку центрифугировали (при 1500 об/мин 10 мин) и готовили шкалу гемолиза:

100 % гемолиз эритроцитов на дистиллированной воде	0,1	0,2	0,3	0,4	0,5	0,6	0,7	0,8	0,9	1,0
Буферный раствор, мл	0,9	0,8	0,7	0,6	0,5	0,4	0,3	0,2	0,1	0
Гемолиз, %	10	20	30	40	50	60	70	80	90	100

Полученные разведения и исходный раствор колориметрировали на ФЭК в кюветах

(1 мм) и строили график зависимости коэффициентов экстинции от процента

гемолиза. На оси абсцисс откладывали процент гемолиза, на оси ординат —

показатели экстинции, соответствующие данному проценту гемолиза.

Расчет 50 % гемолитических единиц комплемента в 1 мл проводили следующим

образом. После титрования исследуемой сыворотки, инкубации ее при 37° С в

течение 45 мин, выдержки в течение 10 мин в холодильнике при 4° С и

центрифугирования пробирку из шкалы гемолиза с одной 50 % единицей

комплемента (№5) сравнивали с пробирками из ряда титрования сыворотки. Если

содержимое пробирки №5 соответствовало по цвету пробирке №6, из ряда

титрования комплемента исследуемой сывороткой, то есть дозе комплемента 0,3

мл, то расчет вели следующим образом.

0,3 мл сыворотки (разведение 1:10) соответствует одной 50 % гемолитической

единице комплемента, а в 1 мл исследуемой сыворотки содержится:

0,3 мл (1:10) — 1

1,0 мл — Х

Х = = 3,33 ел/мл.

2.1.9. Определение содержания пропердина в сыворотке крови. Для

определения титра пропердина исследуемую сыворотку разводили

мединал-вероналовым буфером (рН 7,2-7,4), начиная с 1:10 до 1:320. В

центрифужные пробирки вносили по 0,2 мл каждого разведения сыворотки, до 0,2 мл

суспензии инулина (соответствует 3 мг сухого вещества) и по 0,2 мл комплемента

в рабочем титре. В контрольный ряд пробирок вместо инулина добавляли по 0,2 мл

буфера. Все пробы (опытные и контрольные) помещали на 1 ч в термостат при 37°

С, после чего центрифугировали, переносили супернатант в отдельные пробирки по

0,3 мл и добавляли по 0,2 мл стандартной гемолитической системы. Реакцию

учитывали после 20-минутной экспозиции при 37° С. За титр пропердина принимали

то наибольшее разведение сыворотки, в котором наблюдается полная задержка

гемолиза, и в каком разведении в контрольном ряду отличается полный гемолиз.

Данные рассчитывали по формуле:

Разведение, в котором отмечен полный гемолиз в контроле	—	Разведение, в котором отмечена полная задержка гемолиза в опыте	×10
Разведение, в котором отмечен полный гемолиз в контроле

Полученные результаты выражали в ед/мл. При полной задержки гемолиза в

разведении 1:35 в опыте, а в контроле — полный гемолиз в разведении 1:50,

содержание пропердина в 1 мл испытуемой сыворотки составляет:

×10 = 3 ед/мл.

Тестированные показатели: комплементарную, лизоцимную, пропердиновую

активность, а также содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови, молоке и

молозиве крупного рогатого скота определяли по методам В. Г. Дорофейчук,

1968; X. Я. Грант, Л. И. Яворский, И. А. Блумберг, 1973; И. М. Архангельский,

1976; В. Н. Андреев, Г. И. Подопригора, 1977; Е. С. Фортинская, А. М.

Наумова, Е. А. Маркова, 1977; О. Н. Грызлова, П. А. Емельяненко, В. Н.

Денисенко, 1978; Э. Бем, 1979; П. А. Емельяненко, О. И. Грызлова, Г. Н.

Печникова и М. Н. Тулупова, 1980; Э. С. Коган, 1981; Г. В. Павлов, Г. Н.

Печникова, Смолянская- О. О. Суворова, 1988; В. В. Биктимиров, 1993.

При определении лизоцима, учитывая замедленную активность фермента крупного

рогатого скота, приводили тщательную подготовку материалов к исследованию,

чтобы избежать ошибок, связанные с действием на тест-микробы других

литических факторов исследуемой пробы.

При тестировании комплементарной активности сыворотки крови тщательно

осуществляли подбор индикаторной системы чувствительной к комплементу

крупного рогатого скота.

Для определения пропердина использовали модифицированный метод предложенный

П. А. Емельяненко и др., 1980.

2.1.10. Изучение бактерицидной активности сывороток крови. Для

определения бактериостатической и бактерицидной активности сывороток крови О.

В. Смирнова, Т. А. Кузьмина (1966) предложили фотонефелометрический метод.

В нашей работе мы учитывали изменения оптической плотности питательной среды

с микробами и питательной среды с испытуемой сывороткой крови и микробами

сразу после соединения и через 3-, 5-, 7-, 9-, 12- и 24-часовой инкубации.

Для нефелометрического метода чистую культуру Е. coli высевали на

МПА и выращивали в термостате при температуре 37° С в течение 24 ч. Затем

смывали стерильным изотоническим раствором хлористого натрия и стандартизовали

до содержания в 1 мл 2 млрд. микробных тел. Из этой взвеси производили посев на

МПБ в пробирки и сутки выращивали в термостате при вышеуказанной температуре.

Для определения бактерицидной активности сывороток крови мы использовали

питательную среду (обогащенный пептоном бульон Хоттингера), содержащую 200

мг% амминного азота.

В стерильные кюветы с рабочей длиной 10 мм стерильной пипеткой разливали по 4,5

мл бульона Хоттингера, затем добавляли по 0,5 мл испытуемой сыворотки крови и

суточную бульонную культуру Е. coli по одной бактериологической

петле (диаметр петли 4 мм).

Контрольные кюветы заполняли теми же компонентами, что и опытные с той лишь

разницей, что в один кювет вместо сыворотки добавили 0,5 мл стерильного

изотонического раствора хлорида натрия. Содержимое всех кювет тщательно

перемешивали стерильной стеклянной палочкой, после чего все кюветы закрывали

ватно-марлевыми пробками. Оптическую плотность среды определяли на

фотоэлектроколориметре ФЭК-М, используя зеленый светофильтр. После этого

кюветы ставили в термостат при температуре 37° С. Повторно определяли

оптическую плотность содержимого кювет через 3, 5, 7, 9, 12 и 24 ч. Установку

«0» на ФЭК-е производили с помощью кюветы, заполненной дистиллированной

водой. Оценку бактерицидной активности сыворотки крови проводили по формуле:

А=100-

×100,

Где: А — бактерицидная активность (в %);

Д — оптическая плотность;

Т — время экспозиции кювет в термостате (в часах).

Затем вычисляли среднюю «напряженность бактерицидной активности» (НБА) по

формуле:

Средняя НБА = ,

Где: НБА — средняя напряженность бактерицидной активности молозивной сыворотки;

А1, А2, А3.....Аn — бактерицидная

активность сыворотки молозива через 3, 5, 7, 9, 12 и 24ч (в %);

Т1, Т2, Т3....... Тn — продолжительность термостатирования (в часах).

2.1.11. Постановка опсонофагоцитарной реакции. При постановке

опсонофагоцитарной реакции руководствовались методикой, описанной В. Я. Мозгис

(1982). Для приготовления антигена культуру Е. coli выдерживали

в термостате при температуре 37° С в течение 18-24 ч в МПБ, а затем на МПА в

течение 24 ч. Проверяли на чистоту и смывали стерильным изотоническим раствором

хлорида натрия. По оптическому стандарту доводили концентрацию до 2-х млрд.

микробных тел в 1 мл. Приготовленную взвесь нагревали в водяной бане при 70° С

в течение 30 мин.

Для опсонофагоцитарной реакции применяли только суточную агаровую культуру

Е. coli.

Исследования проводили в следующей последовательности. В пронумерованные

стерильные пробирки наливали до 0,5 мл 2 % прокипяченного и охлажденного

раствора лимоннокислого натрия, 1 мл крови от исследуемых телят и тщательно

смешивали, сюда же вносили по 0,5 мл антигена. После осторожного

перемешивания пробирки помещали в термостат при 38° С на 3 мин,

предварительно погрузив их на 2-3 мин в водяную баню с температурой 38° С.

Затем пробирки из термостата извлекали, готовили мазки, сушили на воздухе,

нумеровали, фиксировали в метиловом спирте в течение 5 мин и окрашивали по

Романовскому-Гимза.

Для приготовления рабочего раствора краски, дистиллированную воду усредняли

фосфатными буферами: 1. Двухосновной фосфат натрия (Na2HPO4

×12H2O) — 17,814 г на 1 л (рН 8,302). 2. Одноосновной фосфат

калия (KH2PO4) — 13,638 г на 1 л (рН 4,529). Если к литру

дистиллированной воды прибааляли по 5 см3 того и другого раствора,

то рН такой воды был равен 6,813.

Краску готовили ex tempore из расчета 1,5 капли краски на 1 мл усредненной воды

с рН 6,813. Мазки окрашивали в течение 45 мин, промывали водопроводной водой и

высушивали на воздухе. Окрашенные мазки исследовали под иммерсионной системой

микроскопа и окуляра 7×.

Подсчет фагоцитированных микробов производили в 100 нейтрофилах. На основе

подсчета определяли фагоцитарную интенсивность (среднее число поглощенных

микробов одним нейтрофилом) и фагоцитарную активность (процент фагоцитирующих

нейтрофилов). С кровью подопытных животных поставили 450 реакций.

2.1.12. Определение содержания иммуноглобулинов в сыворотке крови, молозиве и

молоке крупного рогатого скота.

Предварительно готовили фосфатный буфер 0,03М, рН 3,0. С этой целью 10,74 г

натрия фосфорнокислого двух замещенного (Na2HPO4

×12H2O) и 5,84 г хлорида натрия помещали в мерную колбу,

растворяли в дистиллированной воде и доводили объем до 1 л. Подобным образом

готовили раствор из 4,08 г однозамещенного фосфорнокислого калия (KH2

PO4) и 5,84 г хлорида натрия.

Растворы под контролем потенциометра смешивали в соотношении обеспечивающим

рН буфера 8,0.

Пробы сывороток крови получали путем выдержки взятой крови из яремной вены

животных 20-30 мин при 37° С в термостате. После отделения образовавшегося

сгустка от стенок пробирок стеклянной палочкой, кровь помещали на 16-20 ч в

холодильник. На следующий день сыворотку отсасывали в стерильную центрифужную

пробирку, центрифугировали 15-20 мин при 3000 об/мин.

Пробы молозива и молока после взятия выдерживали 16-20 ч при 4° С и

центрифугировали в течение 1 ч при 6000 об/мин. Затем снимали верхний слой

жира, отсасывали надосадочную жидкость, которую и использовали для

определения.

Пластинки из 3 %-ного агара «Дифко», смешанного с антисывороткой готовили

следующим образом: 360 мг агара помещали в колбу, заливали 12 мл буфера и

прибавляли 0,25 мл 1 %-ного раствора мертиолата. Колбу помещали в баню с

холодной водой, которую затем нагревали до кипения и выдерживали смесь до

полного расплавления агара.

После расплавления гель охлаждали до 56° С и к нему приливали равный объем

антисыворотки в рабочем разведении и снова нагревали до температуры 56° С.

Смесь тщательно перемешивали и выливали на стекло, помещенное на столике с

уровнем в строго горизонтальном положении.

После застывания геля в нем делали лунки диаметром 2 мм на расстоянии 15 мм

друг от друга.

При определении содержания иммуноглобулина G пробы сыворотки крови разводили

буфером рН 8,0 в 20 и 30 раз. Пробы молозива первого дня лактации в 100, 50 и

20 раз, пробы молозива последующих дней лактации — в 50, 20 и 10 раз,

использовали не разведенные и разведенные в 10 раз пробы молока.

При определении содержания иммуноглобулина М пробы сыворотки крови и молозива

разводили в 10 и 5 раз, пробы молока использовали не разведенными и

разведенными в 5 раз.

При определении содержания иммуноглобулина А пробы сыворотки крови

использовали не разведенными, пробы молозива и молока — не разведенными и

разведенными в 5 и 2 раза.

Пробы сыворотки крови получали от новорожденных телят до приема молозива во

всех случаях использовали не разведенными.

Подготовленные пробы крови, молозива, и молока вносили в лунки геля с

антисывороткой с помощью пастеровской пипетки. При этом лунку заполняли

полностью, не переливая пробы за ее пределы.

Параллельно с опытными пробами на каждом стекле ставили контроль — разливали

в лунки стандартный препарат определенного иммуноглобулина. При этом его

разводили буферным раствором с таким расчетом, чтобы в 1 мл раствора

препарата содержалось 5,0; 2,0; 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мл белка. Таким образом,

на каждом стекле получалось 6 лунок с контрольной пробой препарата.

После заполнения лунок, стекла помешали в эксикатор с водой и выдерживали при

комнатной температуре, при определении содержания иммуноглобулинов G и А в

течение 24 ч, а при определении иммуноглобулина М — 48 ч.

По окончании сроков инкубации стекла извлекали из эксикатора и измеряли

диаметр кольца преципитата вокруг лунок с помощью линейки Беринг-Верке, после

окрашивания агаровых пластин. С этой целью стекла с агаром погружали на двое

суток в буфер. В течение этого срока буфер трижды заменяли новой порцией.

После отмывания от не участвующих в реакции веществ, пластинки агара

высушивали при комнатной температуре под фильтровальной бумагой. Затем

пластинки (без фильтровальной бумаги) помещали в 0,1 %-ный раствор амидо-

черного 10В на 3 ч, промывали трехкратно раствором уксусной кислоты и

высушивали.

Для приготовления 0,1 %-ного раствора амидо-черного 10В, брали 1 г краски,

растворяли в 100 мл ледяной уксусной кислоты (СН3СООН), после чего

объем раствора доводили дистиллированной водой до 1 л. Раствор хранили в темной

посуде при комнатной температуре. Раствор уксусной кислоты для промывания:

брали 70 мл ледяной уксусной кислоты и доводили объем дистиллированной водой до

1 л.

Для расчета содержания иммуноглобулинов в испытываемых пробах строили

калибровочную кривую на полулогарифмической бумаге: на оси ординат

откладывали концентрацию белка в пробах стандарта, по оси абсцисс — диаметр

кольца преципитации. Калибровочную кривую строили отдельно по каждому

иммуноглобулину определенного класса.

Количество иммуноглобулина в испытуемой пробе определяли путем сравнения

диаметра кольца преципитации вокруг ее лунки с калибровочной кривой [G.

Mancini, A. O. Carbonara and J.F. Heremans, 1965; У. Дж. Герберт, 1974; В. М.

Чекишев, 1977; П. А. Емельяненко, О. И. Грызлова, Г. Н. Печникова и М. Н.

Тулупова, 1980; P. В. Петров, 1987; Н. С. Жосан, 1989; Н. В. Матузенко, Е. В.

Андреев, А. И. Собко, 1990].

2.1.13. Экспресс-метод для определения содержания иммунных глобулинов.

Кровь получали от телят из яремной вены до приема молозива и через 24 ч после

рождения. Сначала ее выдерживали около часа в (30-35° С), а затем в

холодильнике 10-12 ч. После чего отделяли сыворотку в отдельные пробирки.

Раствор цинк сульфата (208 мг/л ZnSO4×7H2O) готовили

в мерной колбе на дистиллированной воде, которую выдерживали 4-5 дней и затем

кипятили в течение 10-15 мин с целью растворения диоксида углерода.

Для приготовления стандарта мутности брали 3 мл раствора хлорида бария (BaCl

2×2H2O) в 100 мл дистиллированной воды, вносили в мерную

колбу на 100 мл и доводили до метки 0,2N раствором серной кислоты. Полученный

раствор соответствует 20 ед. цинк сульфатному тесту [A. D. MсEwan, E. W.

Fisher, I. E. Selman and W. J. Penhale, 1970].

Калибровочную таблицу для калориметрического определения содержания

иммуноглобулинов на ФЭК-56М получали путем разведения стандарта мутности.

Для определения иммунных глобулинов подбирали пробирки одинакового диаметра и

наливали в каждую по 6 мл цинк сульфатного раствора, а в контрольною пробирку

— 6 мл дистиллированной воды. Во все опытные пробирки (по количеству

образцов) и в контрольную добавляли по 0,1 мл исследуемой сыворотки и

выдерживали при комнатной температуре (20° С) 60 мин. После экспозиции

пробирки взбалтывали, чтобы обеспечить одинаковое перераспределение осадка и

помещали в фотоэлектроколориметр, который предварительно устанавливали на «0»

по дистиллированной воде. Измерение проводили на ФЭК-56М, ври длине волны

400±5 нм (синий светофильтр) в кюветах толщиной слоя 10 мм. Показание прибора

ФЭК-56М определяли образцах сыворотки через контрольную пробирку умножением

различия на фактор 10. 20 единиц цинк сульфатного теста помутнения были

эквивалентны соответственно 20-30 мг/мл содержания колостральных иммунных

глобулинов в сыворотке крови теленка [A. D. MсEwan, E. W. Fisher, I. E.

Selman and W. J. Penhale, 1970].

2.1.14. Определение уровня пассивной защиты у новорожденных телят. Метод

основан на том, что белки сыворотки крови могут преципитироваться различными

солями, включая сульфит натрия (Na2SO3). Этот феномен

зависит от концентрации соли и молекулярной характеристики белков. Готовили

14-, 16-, и 18 %-ный растворы Na2SO3, используя для этих

целей безводный реактив. Соответственно 14, 16 и 18 г его растворяли в 100 мл

дистиллированной воды. Кроме безводного сульфита натрия использовали Na2

SO3×7Н2О, при этом количество его для приготовления

соответствующих концентраций увеличивали вдвое.

В пробирки вносили по 1,9 мл раствора сульфита натрия каждой концентрации и

добавляли по 0,1 мл испытуемой сыворотки. Пробирки тщательно встряхивали и

выдерживали 1 ч при комнатной температуре. Реакцию считали отрицательной,

если преципитат не образуется и положительной, если видны хлопья

преципитированного белка или заметно даже небольшое его присутствие, в данном

случае уровень иммуноглобулинов в испытуемой сыворотке соответствует

промежуточному значению. Концентрация иммуноглобулина меньше 5 мг/мл

соответствовала помутнению при концентрации 18 %; от 5 до 15 мг/мл — 16 и 18

%, и больше 15 мг/мл — 14, 16 и 18 % сульфита натрия. [N. E. Pfeiffer, T. C.

McGuire, 1977; N. E. Pfeiffer, T. C. McGuire, R. E. Bendel and J. M Weikel,

1977; Ю. Н. Федоров, 1988].

Сывороточный гемолиз не влиял на результаты преципитации иммуноглобулинов.

2.1.15. Выделение лактоглобулина из колостральной сыворотки.

Лактоглобулины из сыворотки молозива получали солевым методом. За основу взяли

методику фракционного высаливания противогриппозных сывороток.

К сыворотке добавляли два или три объема дистиллированной воды в зависимости

от содержания белка. В смесь, при перемешивании мешалкой, добавляли тонкой

струей насыщенный раствор сернокислого аммония. После тщательного

перемешивания смесь оставляли в покое на 10-15 ч в холодильнике до полного

формирования осадка.

Лактоглобулин сыворотки молозива подвергался высаливанию 38 объемными

процентами насыщенного раствора сернокислого аммония по формуле:

Х=,

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8