 |
РУБРИКИ |
Диплом: Состояние естественной резистентности и иммунологической реактивности у новорожденных телят при колибактериозе |
РЕКОМЕНДУЕМ |
||
|
Диплом: Состояние естественной резистентности и иммунологической реактивности у новорожденных телят при колибактериозеколиинфекции указывали Th. Smith and R. B. Little, 1922; Th. Smith and R.B. Little, 1922b еще в 20-х годах нашего столетия. Первоначальным фактором, связанным с восприимчивостью телят к Е. coli инфекции, является отсутствие в их сыворотке иммуноглобулинов [С. С. Gay, S. M. Parish, T. C. McGuire 1982].
Таблица 2.13Динамика накопления иммуноглобулина А в сывороткекрови телят (n=16)
У некоторых телят, которые получали молозиво, этот дефицит имеет место подчеркивал C. C. Gay, 1984. По-видимому, некоторые из этих телят утрачивали способность к абсорбции иммуноглобулинов из молозива в течение 4-6 ч после рождения. Факторы, контролирующие абсорбцию гамма глобулинов у новорожденных телят и потеря гаммаглобулинов из их сыворотки, не известны. Потеря гаммаглобулинов из сыворотки телят случается при экскреции в мочу и фецес при нормальном катаболизме. Количество гаммаглобулинов, экскретирующихся в фецес, заметно увеличивается у телят при диареи. Телята меньше 2-недельного возраста не продуцируют антител после энтеробактериальной О-антигенной (Е. coli) инокуляции. Способность реагировать на антигенную инокуляцию зависит от возраста телят и естественно от иммуногена [С. С. Gay, 1971]. Глобулиновая фракция молозива, ответственная за защиту телят не была идентифицирована, несмотря на то, что различные антитела, имеющиеся в молозиве, трансформируются в сыворотку неонатальных телят [R. Aschaffenburg, S. Bartlett, S. K. Kon, P. Terry, S. Y. Thompson and D. M. Walker, 1949a; R. Aschaffenburg, S. Bartlett, S. K. Kon, D. M. Walker, C. Briggs, E. Cotchin and R. Lovell, 1949b]. Антигены приготовили из трех серотипов Е. coli. Серотипы О78:К80; О119:К69; О137:К79 были изолированы от телят с инфекционной диареей в учхозе «Кетросу» района Анений Ной. Бактерии выращивали на МПА 8-10 ч при 37° С в бактериальных матрацах. Клетки смывали из агара стерильным физиологическим раствором хлорида натрия и бактериальную суспензию автоклавировали при 120° С в течение 2 ч для разрушения К-антигена. Густую отмытую суспензию смешивали с ацетоном в отношении 1:5 до появления коагуляции (свертывания). Плотную часть материала отбирали на воронке Бюхнера промытой один раз ацетоном и затем высушенной эфиром. Препарат был высушен на воздухе и сохраняли при 4° С. Сухой порошок применяли для приготовления суспензии антигена, добавляя 1 мг высушенных ацетоном бактерий к 1 мл барбиталового буферам [E. Neter, 1957]. Молозиво получали от 23 коров при первом доении после отела. Двадцать три пробы цельного молока получали от коров средней лактации, сравнивая уровень антител с уровнем в молозиве из того же стада (коровника). Молочную сыворотку приготовляли из молозива и молока и тестировали на антитела, тем же методом что и сыворотку крови. Пробы крови отбирали у телят вскоре после рождения с интервалом 12-24 ч. Кровь выдерживали при комнатной температуре до появления сгустка и сыворотку отделяли в течение 6 ч. Пробы сыворотки крови, молозива и молока хранили при –20° С до тестирования. 2.2.7.1. Серологический тест. Сыворотку инактивировали при 56° С в течение 30 мин для разрушения комплементной активности. Все сыворотки, в том числе молозивные и молочные, абсорбировали с эритроцитами барана, исключая какие либо антитела к эритроцитам. Агглютинирующие антитела определяли по методу E. Neter, E. A. Gorzynski, R. M. Gino, O. Westphal and O. Luderwitz, 1956, за исключением того, что эритроциты барана были утилизированы и был приготовлен антиген, высушенный ацетоном. Антиглобулиновый тест применяли для определения титра не агглютинирующих антител [E. Neter, 1957] используя антиглобулиновую (бычью) сыворотку. Все титрации проводили в двукратном разведении, ранг серии от 2-2 до 2-11 , применяя 0,1 мл разведенной сыворотки и 0,1 мл 2 % суспензии антигена с эритроцитами барана, которые были промыты 3 раза после антигенной абсорбции. Агглютинационный тест учитывали после 10-120 минутной выдержки при комнатной температуре. Антиглобулиновый тест определяли после инкубации в термостате при 37° С в течение 1 ч и выдержки в холодильнике при 4° С в течение 12 ч. Высшее сывороточное разведение, которое имело хорошо выраженную агглютинацию, учитывали как титр этой сыворотки. Чувствительность антител к 2-меркаптоэтанолу определяли инкубированием сыворотки на 0,1М растворе CH2SH‑CH 2OH, при 37° С в течение 30 мин. Резистентность к этой обработке была взята как показание, что антитела не являются макроглобулинами. 2.2.7.2 Абсорбционный тест. Определение специфичности антител абсорбционным методом было проведено с сывороткой молозива и крови телят. Сывороточные образцы получали от телят через 12-24 ч после кормления молозивом, и были разделены по уровню антител против трех антигенов. Сыворотку молозива и сыворотку крови телят абсорбировали с каждым из трех серотипов Е. coli , которые инкубировали в колбе-матраце на МПА.
Таблица 2.14Уровень колостральных антител против О-антигеновЕ. coli в сыворотке молозива коров
Микроорганизмы смывали из агара барбиталовым (вероналовым) буфером и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 30 мин. Затем бактерии прибавляли к сыворотке крови телят и молозивной сыворотке — 2×1011 бактерий на 1 мл пробы. Абсорбцию проводили при 37° С в течение 60 мин и суспензию центрифугировали при 12000 об/мин в течение 30 мин. Супернатант сыворотки крови телят и молозивной сыворотки удаляли из массы клеток и выдерживали при ‑20° С до тестирования. Пробы имели достоверный титр антител против всех трех антигенов за исключением 2-х проб, которые не имели агглютинирующих антител против О78:К80, но имели антитела, обнаруживаемые антиглобулиновым тестом в титрах 7-8. В двух других образцах сыворотки молозива отсутствовали антитела, выявляемые антиглобулиновым тестом против О-антигена О137:К79, но имели агглютинирующие антитела в титрах от 2 до 5. Высшую среднюю активность агглютинирующих и антиглобулиновых антител отмечали против О137:К79. Затем в порядке уменьшения активности антител к О-антигену были О119:К69 и О78:К80. Титры агглютинирующих и антиглобулиновых антител в сыворотке молока были значительно меньшими, чем в сыворотке молозива и, в дополнение, сфера действия антител была более ограниченной. Учитывали только средний титр антител реагирующих против специфических О-антигенов Е. coli: О78:К80, О119:К69, О137:К79 (табл. 2.14; 2.15).
Таблица 2.15Уровень антител против О-антигенов Е. coli в сыворотке молока коров
2.2.7.3. Уровень антител против О-антигенов Е. coli в сыворотке крови новорожденных телят. Активность антител не была обнаружена в сыворотке неонатальных телят перед кормлением молозивом. После выпаивания молозива сывороточные образцы от 23 телят взаимодействовали с одним или тремя тестированными О-антигенами. Количество сывороточных проб и процент положительных тест реакций представлен в табл. 2.16, из которой следует, что некоторые сыворотки реагировали только в антиглобулиновом тесте, в агглютинационном тесте реакция была отрицательной. Все сыворотки тест позитивные в агглютинационном опыте, тестировались и в антиглобулиновой реакции. Обработка исследованных сывороток этантиолом показала примерно те титры антител, которые были определены агглютинационным и антиглоблииновым методами.
Таблица 2.16Количество образцов с положительным тест результатомпри исследовании уровня антител против О-антигенов Е. coli в сыворотке крови неонатальных телят.
Результаты титрации парных образцов сыворотки молозива, полученного при первом доении коров и сыворотки, приготовленной из крови телят через 12-24 ч после кормления молозивом представлены в табл. 2.17. В таблице учтены только тест позитивные реакции против специфических О-антигенов Е. coli : О78:К80, О119:К69, О137:К79. В некоторых пробах титр антител в сыворотке крови телят был незначительно выше или равнялся уровню антител в сыворотке молозива. Тем не менее, средний титр в сыворотке крови телят был почти на два разведения меньше, чем в сыворотке молозива.
Таблица 2.17Уровень антител против О-антигенов Е. coli вспаренных сыворотках молозива и крови неонатальных телят.
2.2.7.4 Абсорбция антител против О-антигенов Е. coli из сыворотки молозива и крови телят. Две пробы сыворотки молозива и 3 сыворотки крови однодневных телят были абсорбированы Е. coli антигеном для определения специфичности антител. Данные, полученные абсорбционным тестом, представлены в табл. 2.18. Все исследуемые пробы, абсорбированные антигеном, подавляли активность антител к антигену, в то же время, как правило, превосходили антитела против других антигенов. Антитела против антигена О137:К79 имели влияние на абсорбцию по сравнению с другими антигенами. Почти все пробы сывороток имели антитела в высоких титрах против О-антигенов к трем серотипам Е. coli . Сходные антитела были выявлены в нормальном молоке в меньшей степени и в значительно низких титрах. Колостральные антитела вероятно, отражали контакт (инфицирование) коров с различными серотипами Е. coli . Титр антител против О78:К80 был наименьшим из трех тестированных антигенов. Результаты абсорбционного теста указывают, что антитела против О78:К80 наиболее легко абсорбируются по сравнению с другими серотипами Е. coli . Эти данные указывают, что антитела реагирующие с О78:К80 не обладают высокой специфичностью и могут вступать в перекрестную реакцию с другими микроорганизмами, инфицирующими коров. Высокий уровень антител, выявляемый в сыворотке молозива, соответствовал и высокому уровню антител в сыворотке крови телят через несколько часов после кормления молозивом.
Таблица 2.18Показатели абсорбции антител против О-антигенов Е.coli молозивом и сывороткой неонатальных телят.
* Титр выражен в log2 АГТ — агглютинационный тест АНТ — антиглобулиновый тест Антитела в сыворотках молозива и крови однодневных телят были резистентными к инактивации CH2SH-CH2OH-меркаптоэтанолом, что указывает на то, что они не являются макроглобулинами. Этот результат подтверждает данные, что антитела не продуцируются новорожденными телятами, а приобретаются после рождения из молозива. У семи из 23 телят, кормившихся молозивом, активность агглютинирующих антител против трех О-антигенов Е. coli не была установлена. Эти же телята имели и низкий уровень иммуноглобулинов после кормления молозивом, что указывает на анормальную абсорбцию иммуноглобулинов из желудочно-кишечного тракта.
2.2.8. Уровень антител против К-антигенов Е. coli в нормальномкоровьем молозиве, молоке и в сыворотке крови новорожденных телят. Большое значение молозива в защите неонатальных телят от колибактериоза было установлено давно [Th. Smith and R. B. Little, 1922]. Полагают, что молозиво обеспечивает защиту в ассоциации с принадлежащей ему активностью антител против Е. coli и, особенно, с содержащими агглютининами к К-антигену [B. Kaijser, S. Ahlstedt, 1977]. Значение К агглютининов, как фактора в молозиве, который защищает телят против колибактериоза установили [С. J. Howard, A. A. Glynn, 1971], после того как некоторые телята приобретали после рождения агглютинины из молозива, которые реагировали с К-антигеном из штаммов Е. coli ассоциирующими с заболеванием. Агглютинины к К-антигену из Е. coli ассоциировались с увеличением вирулентности микроорганизмов [С. С. Gay, S. M. Parish, T. C. McGuire 1982]. Следовательно, антитела против К-антигена считают доказанным фактором в резистентности неонатальных телят против Е. coli инфекции. Вначале исследования по определению антител в К-антигену, проводили прямой агглютинацией к идентифицированным микроорганизмами [E. Neter, E. A. Gorzynski, R. M. Gino, O. Westphal and O. Luderwitz. 1956]. Более чувствительные методы выявления антител в человеческой крови из пуповины к энтеробактериальным антигенам были установлены при применении пассивной гемагглютинации [E. Neter, 1957]. Антитела, выявляемые этими чувствительными гемагглютинационными тестами, могут быть существенными в увеличении резистентности неонатальных телят против колибактериоза. Эти антитела, пассивно приобретенные после рождения телятами из молозива коров, были тестированы в динамике. В опыте находились 23 телят черно-пестрой породы в первые 5 дней. Телят кормили молозивом, а затем свежим молоком. Антигены приготовляли из трех серотипов Е. coli . Серотипы О78:К80, О119:К69 и О137:К79 были изолированы от телят с инфекционной диареей в учхозе «Кетросу» района Анений Ной. Бактерии выращивали на кровяном агаре, при этом гладкие и слизеподобные колонии пересевали на агар Мак-Конки. Часть колоний из агара Мак Конки были тестированы пластинчатой реакцией агглютинации (на предметном стекле со специфическими К-антисыворотками). Колонии-тест-положительные были отобраны для приготовления К-антигена Е. coli. Культивирование бактерий и приготовление антигенов было сходным с получением О-антигенов Е. coli за исключением того, что Е. coli применявшаяся для приготовления К-антигена не нагревалась, и для смыва бактерий использовали солевой раствор (0,85 %), содержащий 0,5 % формальдегида. Бактерии были экстрагированы при добавлении ацетона непосредственно после их смыва с агаровой культуры и промыты. Пробы молозива отбирали от 23 коров в молочном стаде учебного хозяйства при первом доении после отела. Двадцать три пробы цельного молока получали от коров средней лактации, сравнивая уровень антител с уровнем в молозиве. Молочную сыворотку приготовляли из молозива и молока и тестировали на антитела, подобным методом, как и сыворотку крови. Пробы крови отбирали у телят вскоре после рождения с интервалом 12-24 ч. Кровь выдерживали при комнатной температуре до появления сгустка и сыворотку отделяли в течение 6 ч. Пробы сыворотки крови, молозива и молока хранили при -20° С. 2.2.8.1. Серологический тест. Для разрушения комплементной активности сыворотку инактивировали при 56° С в течение 30 мин. Все сыворотки в том числе молозивные и молочные, абсорбировали с эритроцитами барана, исключая какие-либо антитела к эритроцитам. Агглютинирующие антитела определяли по методу Е. Neter (1957), за исключением того, что эритроциты барана были утилизированы и был приготовлен антиген высушенный ацетоном. Антиглобулиновый тест применяли для определения неагглютинирующих антител [E. Neter, 1957], применяя антиглобулиновую (бычью) сыворотку. Все титрации проводили в двукратном разведении ранг серии от 2-2 до 2-11 , применяя 0,1 мл разведенной сыворотки и 0,1 мл 2 % суспензии антигена с эритроцитами барана, которые были промыты 3 раза после антигенной абсорбции. Агглютинационный тест учитывали после 90-120 минутной инкубации при комнатной температуре. Антиглобулиновый тест определяли после 1 ч инкубации в термостате при 37° С и 12 ч экспозиции в холодильнике при 4° С. Предельное сывороточное разведение, которое имело хорошо выраженную агглютинацию, учитывали как титр этой сыворотки. Чувствительность антител к 2-меркаптоэтанолу определяли инкубацией сыворотки в 0,1М растворе CH2 SH-CH2OH при 37° С в течение 30 мин. Резистентность к этой обработке была взята как показание, что антитела не являются макроглобулинами. 2.2.8.2. Абсорбционный тест. Определение специфичности антител абсорбционным методом было проведено с сывороткой молозива и крови телят. Сывороточные образцы получали от телят через 12-24 ч после кормления молозивом и были разделены по уровню антител против трех антигенов. Сыворотку молозива и сыворотку крови телят абсорбировали с каждым из трех серотипов у Е. coli . Три серотипа Е. coli инкубировали в колбе-матраце на МПА. Микроорганизмы смывали из агара барбиталовым (вероналовым) буфером и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 30 мин. Затем бактерии прибавляли к сыворотке крови телят и молозивной сыворотке из расчета 2×1011 бактерий на 1 мл. Абсорбцию проводили при 37° С в течение 60 мин и суспензию центрифугировали при 12000 об/мин 30 мин. Супернатант сыворотки телят и молозивной сыворотки удаляли из массы клеток, а осадок хранили при -20° С до тестирования. 2.2.8.3. Уровень антител против К-антигенов в сыворотках молозива и молока. Средний титр антител в молозивной сыворотке против К антигенов из 3 штаммов Е. coli представлен в табл. 2.19. Агглютинирующиеся антитела выявляются менее часто, чем антиглобулиновые антитела в тестированных образцах молозива. Положительный тест — результат установлен соответственно в 53,83 % (антиген О78:К80) и 88,24 % (антиген О137:К79) случаев. Средний титр антител в аналогичных условиях равнялся 4,63±0,73 и 6,87±0,56.
Таблица 2.19.Уровень колостральных антител против К-антигеновЕ. coli в сыворотке молозива коров
Из 69 исследованных проб сывороток молозива агглютининовым и антиглобулиновым тестами 9 проб имели антитела, обнаруживаемые только антиглобулиновым методом. Средний титр антител был существенно выше при тестировании антиглобулиновым методом по сравнению с агглютинационным, тем не менее, в 4 образцах получены совпадающие результаты, а в одном случае титр агглютининов был выше на одно разведение. Средний титр был вычислен только из тест положительных образцов. Высокий титр антител был установлен агглютинационным и антиглобулиновым методами против К антигена серотипа О137:К79 (6,25±0,69 и 6,87±0,56). Результаты исследования образцов молока, полученного от коров на различных стадиях лактации, показаны в табл. 2.20. Антитела против Е. coli К-антигена были обнаружены в молоке агглютинационным и антиглобулиновым методами, но частота и уровень активности антител были намного меньшими, чем в молозиве.
Таблица 2.20Уровень антител против К-антигенов Е. coli в сыворотке молока коров
Двенадцать из 37 проб (тест положительных) сывороток молока имели антитела против 3 тестированных антигенов. Причем 12 проб были тест положительными при исследовании как агглютинационным, так и антиглобулиновым тестами, 27 тест положительных проб выявляли только антиглобулиновым методом. Из 14 проб сывороток молока выявляли антитела против К антигена Е. coli штамм О78:К80 в трех совпадающих пробах агглютинационным и антиглобулиновым методом. Антитела к К антигену Е. coli штамм О119:К69 выявлены тестированными методами из 13 проб в 3 случаях и дополнительно в 5 случаях только антиглобулиновым методом. Антитела к К антигену Е. coli штамм О137:К79 выявляли в 6 совпадающих случаях обеими методами и дополнительно в 5 пробах только антиглобулиновым методом. 2.2.8.4. Уровень антител против К антигена в сыворотке новорожденных телят. Результаты исследования сывороточных проб телят в возрасте от 1 до 5 дней указывает, что большинство телят приобретают после рождения антитела, выявляемые антиглобулиновым, а не агглютинационным тестом. Сопоставление уровня антител в сыворотке молозива и в сыворотке крови телят через 12-24 ч после кормления молозивом, представлены в табл. 2.21.
Таблица 2.21Уровень антител против К-антигенов Е. coli вспаренных сыворотках молозива и крови неонатальных телят.
В нескольких случаях титр антител в сыворотке крови телят был эквивалентным уровню колостральных антител, но, как правило, титр антител в сыворотке телят был меньшим на 1-2 разведения, чем титр в сыворотке молозива. Телята, лишенные молозива, не содержали антител против К антигена Е. coli тестированных серотипов. Антитела в молозиве и антитела в сыворотке неонатальных телят не инактивировались при обработке 2-меркаптоэтанолом CH2 SH‑CH2OH. Средний титр антител в сыворотке крови телят, кормившихся молозивом варьировал в зависимости от тестированных К антигенов Е. coli О78:К80, О119:К69, О137:К79. Существенное различие в уровне антител установлено при их выявлении агглютинационным и антиглобулиновым методами(табл. 2.22). Уровень антител при исследовании антиглобулиновым методом был на 2-3 разведения большим по сравнению с агглютинационным тестом.
Таблица 2.22Количество образцов с положительным тест результатомпри исследовании уровня антител против К-антигенов Е. coli в сыворотке крови неонатальных телят.
2.2.8.5. Абсорбция антител против К-антигенов Е. coli из сыворотки молозива и крови телят. Результаты абсорбционного теста колостральных образцов, полученных от коров при первом доении после отела и сывороточных образцов, взятых у телят в течение 1 дня после кормления молозивом представлены в табл. 2.23. Все исследуемые пробы, абсорбированные антигенами, подавляли активность антител к антигенам Е. coli О78:К80, О115:К69. Антитела против антигена О137:К79 имели наименьшее влияние на абсорбцию по сравнению с другими антигенами. Два серотипа Е. coli О78:К80, О119:К69 имели К антиген В типа, тогда как серотип О137:К79 имел К антиген А типа. Это различие в типах К антигена и имеет значение в перекрестной реакция с серотипом О137:К79.
Таблица 2.23Показатели абсорбции антител против К-антигенов Е.coli молозивом и сывороткой неонатальных телят.
* Титр, выраженный в log2 АГТ — агглютинационный тест АНТ — антиглобулиновый тест Наличие и титр антител против К антигенов Е. coli О78:К80, О119:К69 и О137:К79 в молозиве был ниже, чем антитела против О антигенов в тех же самых пробах. Процент тест положительных молозивных образцов с К-антигенами составлял при исследовании агглютинационным методом от 53,33 да 75,00, а при исследовании антиглобулиновым методом от 53,33 до 88,24, тогда как асе образцы были тестированы положительно с Е. coli О антигенами. Анти-К активность антител в молоке имела частоту и титр ниже, чем активность в молозиве. Пробы молока не имели антител против всех трех К антигенов. Иммуноглобулины в молозиво извлекаются селективной секрецией из сыворотки крови коров. Следовательно, специфичность антител в молозиве определяется специфичностью антител в сыворотке крови коров. Кроме того, уровень антител в сыворотке крови коров зависит от воздействия на иммунокомпетентные клетки специфических иммуногенов, то есть активность антител молозива коров является рефлекторным отражением специфичности антигена. Вероятно, если определенные серотипы Е. coli имеются во внешней среде (коровник, родильное отделение), коровы впоследствии продуцируют специфические антитела и передают их через молозиво телятам. Это имеет место в том случае, когда инвазивные вирулентные серотипы Е. coli вызывают антигенную стимуляцию иммунокомпетентных клеток большую, чем не вирулентные штаммы. Высший средний титр колостральных антител анти-К антигена был установлен против штамма О137:К79. Идентификация антител в сыворотке молозива и в сыворотке крови телят против серотипов О78:К80 и О119:К69 в более низких |
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
© 2010 |
|