 |
РУБРИКИ |
Диплом: Состояние естественной резистентности и иммунологической реактивности у новорожденных телят при колибактериозе |
РЕКОМЕНДУЕМ |
||
|
Диплом: Состояние естественной резистентности и иммунологической реактивности у новорожденных телят при колибактериозегде: Х — объем насыщенного раствора сернокислого аммония; С — требуемая концентрация сернокислого аммония; Y — объем разбавленной молозивной сыворотки. рН насыщенного раствора сернокислого аммония — 7,3-7,5. Выпавший осадок лактоглобулина отделяли от раствора путем фильтрации через воронку Бюхнера с двойным слоем хроматографической бумаги. Плотный осадок переносили в целлофановые мешочки и подвергали диализу в проточной водопроводной воде, а затем в дистиллированной воде до тех пор, пока в растворе не обнаруживалось даже следов сернокислого аммония, что проверяли реактивом Несслера. По окончании диализа определяли концентрацию белка (рефрактометрически) в растворе лактоглобулина и дистиллированной воды разбавляли его до содержания 10 % белка. К раствору добавляли хлорид натрия до изотонического насыщения. Подученный препарат подвергали стерилизующей фильтрации через фильтр Зейтца с пластинкой СФ и расфасовывали по ампулам и флаконам. Стерильность полученного препарата подтверждали высевом на МПБ, МПА и среду Китт-Тарроци, а безвредность на белых мышах и морских свинках. Посевы выдерживали в термостате при 37° С восемь суток. Лактоглобулин вводили подкожно двум морским свинкам массой 230-240 г в дозе по 3 мл и четырем белым мышам массой 16-18 г по 0,5 мл с последующим наблюдением за животными в течение 5 дней. Исключение примесей балластных белков в препарате производили электрофоретически. Препарат хранили в холодильнике при температуре +3 +5° С. 2.2. Изучение специфической иммунологической реактивности телят в постнатальный период. Уровень иммуноглобулинов в сыворотке крови телят до приема молозива и через 24 ч после рождения определяли цинк-сульфатным методом [A. D. MсEwan, E. W. Fisher, I. E. Selman and W. J. Penhale, 1970]. Концентрацию иммуноглобулинов молозива коров с учетом их возраста вычисляли по уровням линейной регрессии [H. Balbierz, M. Nicolaijczuk, J. Zeilinski, 1983]. Эффективность колостральных иммуноглобулинов изучали по отношению содержания иммуноглобулинов в сыворотке крови неонатальных телят к количеству поступивших с молозивом. Количественную характеристику абсорбции колостральных иммуноглобулинов классов G, М и А устанавливали методом радиальной иммунодиффузии [G. Mancini, A. O. Carbonara and J.F. Heremans, 1965; В. М. Чекишев, 1977]. Выделенные иммуноглобулины классов G, М и А служили антигенами для иммунизации кроликов [R. A. Wilson and I. W. Jutila, 1976] с целью получения соответствующих моноспецифических антисывороток. Степень катаболизма иммуноглобулинов изучали определением их классов в сыворотке крови методом радиальной диффузии. Иммуноглобулины в фекалиях определяли по E. F. Logan, W. J. Penhale, 1972; Р. П. Маслянко, 1982. После измерения диаметров зон преципитации концентрацию иммуноглобулинов рассчитывали математическим способом, исходя из прямо пропорциональной зависимости между ней и квадратом диаметра кольца [Э. Бем, 1979]. Колостральную сыворотку отделяли после добавления сычужного фермента. Лактоглобулин получали добавлением к сыворотке молозива насыщенного раствора сульфата аммония с последующим диализом против 0,01М рН 7,6 Na2HPO 4; KН2PO4. Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием критерия достоверности Стьюдента. 2.2.1. Уровень иммуноглобулинов в сыворотке крови телят до приема молозива и через 24ч после рождения и взаимосвязь между концентрацией иммуноглобулинов и проявлением синдрома нарушения пищеварения. Проведенные исследования показали, что концентрация колостральных иммунных глобулинов в крови телят до приема молозива составила 0,18±0,08 мг/мл, этот уровень главным образом связан с IgМ. Через 24 часа после приема молозива содержание иммуноглобулинов достигло 23,94±1,71 мг/мл или увеличилось в 133 раза (табл. 2.1). Таблица 2.1Содержание иммунных глобулинов в сыворотке крови новорожденных телят (n=20).
Новорожденные телята с содержанием иммуноглобулинов 23,94± 1,71 мг/мл (доверительный интервал 19,19-28,69 мг/мл) переболели легкой формой колибактериоза на третьи сутки. Даже такая высокая концентрация иммуноглобулинов не обеспечивала иммунологический статус новорожденных телят, что связано со значительной инфицированностью внешней среды и снижением вследствие этого защитного уровня молозива. Содержание иммуноглобулинов через 24 часа в сыворотке крови телят сильно варьирует и составляет от 19,85 мг/мл до 29,11 мг/мл. Такая разница объясняется количеством проглоченного теленком молозива. Способность новорожденных животных адаптироваться к изменениям внешней среды лимитировано и изменение условий, не влияющих на взрослых животных, может плохо отразиться на состояние здоровья телят. Известно, что стресс является способствующим фактором возникновения колибактериоза у телят. Причиной стресса могут быть различные нарушения условий содержания, порой самые безобидные, поэтому предотвратить стресс весьма трудно. Даже перемещение является причиной стресса, который приводит к увеличению уровня заражения инфекционными агентами. Низкая температура, сквозняки, влажная подстилка способствуют возникновению и распространению инфекции. Следовательно, иммунологический статус, необходимый для защиты организма, зависит от количества молозива, проглоченного теленком в первые минуты жизни и условий внешней среды. Исходя из этого, невозможно точно указать количество колостральных иммуноглобулинов, обеспечивающих иммунологическую защиту животных. При концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови телят 18,26±0,18 мг/мл (доверительный интервал 17,77-18,75 мг/мл) заболевание протекает с расстройством пищеварения,и сопровождается средней тяжестью дегидратации а также диареей. Такие телята отказываются от молозива, с трудом поднимаются, задняя часть туловища испачкана фекалиями, влажная. Длительность течения болезни при такой концентрации иммуноглобулинов обычно составляет 4-6 дней. Уровень иммуноглобулинов в сыворотке крови телят с энтеритной формой колибактериоза ниже, чем в контрольной группе (Р<0,05). В сыворотке крови телят III группы концентрация иммуноглобулинов была самой низкой и составляла 15,37±0,19 мг/мл при доверительном интервале 14,82-15,90 мг/мл. По сравнению с контрольной группой изменения в содержании иммуноглобулинов статистически достоверны (Р<0,01). У животных отмечалась септическая форма колибактериоза, депрессия, дегидратация. Течение болезни проявляется профузным поносом, усиленной перистальтикой кишечника, глаза запавшие, телята не способны были стоять на ногах и погибали в 7-10 дневном возрасте. Существенное уменьшение концентрации иммунных глобулинов в данной группе животных ассоциировалось с тяжелой степенью дегидратации и выраженной диареей. Коэффициент вариации в исследуемых сыворотках колебался от 2,29 % во 2-й опытной группе до 15,9 % в контрольной. При бактериологическом исследовании ректальных тампонов и патологического материала выделили вирулентные штаммы Е. coli. Пробы брали до лечения в течение 12 часов с начала диареи. Исходя из результатов исследований, рекомендуем при содержании иммуноглобулинов в сыворотке крови телят суточного возраста 18,26±0,18 мг/мл задавать взамен молока дважды в день 2 л изотонического раствора глюкозы, хлорида натрия и антибактериальные препараты. При концентрации иммуноглобулинов 15,37±0,19 мг/мл, парентерально вводить кровь, сыворотку крови, сыворотку молозива (внутривенно) и антибактериальные препараты. Применение антибиотиков и изотонических растворов глюкозы и хлорида натрия при септической форме колибактериоза не является эффективным, так как выживание телят в таких случаях зависит от высокой концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови. 2.2.2. Количественная характеристика абсорбции колостральных иммуноглобулинов новорожденными телятами. Известно, что здоровье и выживаемость новорожденных, связаны с поступлением в их организм молозива. Природа защитных свойств молозива была предметом длительного изучения, вследствие чего установлено, что одним из определяющих этих свойств факторов являются иммуноглобулины. Иммуноглобулины молозива обеспечивают защиту от так называемой «местной» микрофлоры, так как в результате самопроизвольной антигенной стимуляции этой микрофлорой в организме матерей всегда имеются соответствующие антитела. Всасывание иммуноглобулинов происходит в кишечнике, и через лимфатические пути они попадают в кровь. Иммуноглобулины появляются в лимфе уже через 1-2 ч после поступления их в двенадцатиперстную кишку животных. Факторы, обеспечивающие всасывание нерасщепленных молекул белка, как и причины, по которым впоследствии оно становится невозможным, до настоящего времени изучены недостаточно. J.W.Boyd (1972) указывает на существование специальных внутриклеточных рецепторов узнавания, обеспечивающих селективную передачу белков в кровь. Исследование механизмов транспорта и катаболизма иммуноглобулинов in vitro показало, что на первых этапах всасывания формируется комплекс между иммуноглобулинами и специфическими рецепторами энтероцитов. Во взаимодействии с рецепторами клеток кишечника участвует Fc — фрагмент иммуноглобулинов. По-видимому, связывание иммуноглобулинов с клетками предохраняет их от катаболизма и способствует транспорту в кровь [И. И. Головистиков, 1979]. Высокий уровень иммуноглобулинов в организме новорожденных обеспечивается поступлением необходимого количества молозива в оптимальные сроки. Низкое содержание иммуноглобулинов в крови новорожденных животных связано с недостаточным или слишком поздним скармливанием молозива, низким содержанием иммуноглобулинов в нем, а также нарушением абсорбции. Проведенные нами исследования показали, что концентрация иммунных глобулинов в молозиве подопытных коров изменялась по дням лактации. Так, уровень иммунных глобулинов в молозиве коров первого дня лактации составил 57,02±0,86 мг/мл при доверительном интервале 55,09-58,95 мг/мл. На второй и третий день концентрация иммуноглобулинов составила соответственно 26,42±0,06 и 11,56±0,42 мг/мл при доверительном интервале 26,29-26,55 и 10,40-12,72 мг/мл (табл. 2.2).
Таблица 2.2Содержание иммунных глобулинов в молозиве подопытных коров (n=19)
При изучении концентрации иммунных глобулинов в сыворотке крови телят и в молозиве их коров-матерей установлено, что абсорбция зависит от уровня иммунных глобулинов в молозиве коров, количества принятого молозива, задержки первого кормления, а также от рН молозива. Так, при содержании иммунных глобулинов в молозиве первого дня 59,00±0,59 мг/мл при доверительном интервале 57,36-60,64 мг/мл, уровень колостральных иммуноглобулинов в сыворотке крови телят равнялся 23,096±1,00 (рис. 2.1) при доверительном интервале 20,32-25,87 мг/мл. При концентрации иммуноглобулинов в молозиве 57,02±0,86 и 54,53±0,57 мг/мл (доверительный интервал соответственно равен 55,09-58,95 и 53,25-55,81 мг/мл; содержание колостральных иммунных глобулинов в сыворотке крови телят также изменяется и составляло 18,1±0,11 и 15,06±0,12 мг/мл при доверительном интервале соответственно 17,85-18,35 и 14,79-15,33 мг/мл (табл. 2.3).
Таблица 2.3Содержание иммунных глобулинов в молозиве коров первогодня лактации (n=19).
При изучении эффективности абсорбции колостральных иммуноглобулинов новорожденными телятами нами установлено, что количественная оценка всасывания иммуноглобулинов в контрольной группе составляет 39,21±2,04 % при доверительном интервале 33,55-44,87 процентов. В первой опытной группе (энтеритная форма колибактериоза) и во второй (септическая форма колибактериоза) этот показатель соответственно равнялся 31,78±0,11 % доверительный интервал 31,53-32,03 % и 27,63±0,23 % при доверительном интервале 27,11-28,15 % (табл. 2.4). При бактериологическом исследовании ректальных тампонов и посмертного материала выделили вирулентные штаммы Е. coli . Пробы брали до лечения в пределах 12 часов с начала диареи.
Таблица 2.4Содержание иммунных глобулинов в сыворотке кровиноворожденных телят (n=19).
Следовательно, количественная оценка абсорбции колостральных антител характеризует иммунологический статус новорожденных телят в нашем случае она составляет соответственно 39,21±2,04 % (контрольная группа), 31,78±0,11 (энтеритная форма колибактериоза) и 27,63±0,23 % (септическая форма колибактериоза) (табл. 2.5; рис. 2.2). Таким образом, установлена прямая зависимость между концентрацией иммуноглобулинов в сыворотке крови новорожденных животных и их резистентностью.
Таблица 2.5Показатели абсорбции колостральных иммуноглобулиновноворожденными телятами через 24 ч после рождения (n=19)
2.2.3. Уровень колостральных иммуноглобулинов в сыворотке крови новорожденных телят через 6, 24 и 48 ч после рождения. Иммуноглобулины, обнаруженные в сыворотке крови телят до приема молозива, считаются важнейшими защитными факторами для этих животных. Как правило, это было незначительное количество IgG и IgM (та6л. 2.6). Тем не менее, в отдельных случаях перед приемом молозива наблюдали очень высокий уровень IgM (5,6 мг/мл) и IgG (4,2 мг/мл). IgА не обнаруживался в пробах до приема молозива. В сыворотке крови всех телят устанавливали уровень трех классов иммуноглобулинов в течение 6 ч от рождения, и их максимум достигал к 48 часам. Большое отклонение в иммуноглобулиновом уровне было заметно у, отдельных животных. Двое телят имели уровень IgG 9,4 и 14,42 мг/мл в течение 24 ч от рождения. В противоположность у одного теленка этот показатель равнялся 34,2 мг/мл, что, по-видимому, связано с внутриматочной инфекцией. IgМ более эффективно абсорбируется (63,8 %), чем IgА (47 %) или IgG (11,19 %) в течение 6 ч после рождения. Механизм торможения абсорбции макромолекул последовательный и прогрессирующий, который воздействует на все три класса иммуноглобулинов вскоре после рождения. Установленное снижение в абсорбции различимо между классами и указывает, что механизм торможения независимо действует для каждого класса. Прекращение абсорбции было более быстрым для IgG и медленным для IgА с промежуточной позицией для IgМ. Следовательно, каждый класс иммуноглобулинов абсорбируется независимо, а сам абсорбционный процесс следует рассматривать как неспецифический. Таблица 2.6 Концентрация колостральных иммуноглобулинов в сыворотке крови новорожденных телят (n=7), мг/мл
2.2.4. Количественное определение колостральных иммуноглобулинов в сыворотке крови и в фецес неонатальных телят. Данные табл. 2.7 характеризуют уровень иммуноглобулинов в сыворотке крови и в копрофильтратах у телят, больных колибактериозом. Таблица 2.7Количественные показателииммунных глобулинов в сыворотке крови и копрофильтратах телят при колибактериозе (Х±Sx), мг/мл
Существенное различие была установлено как в общих иммунных глобулинах, так и в отдельных классах иммуноглобулинов. Активность катаболизма имеет существенные различия. Так, сывороточная концентрация IgG у павших телят была в 2,26 раза меньшей, чем у клинически здоровых, концентрация IgМ и IgА также у павших была соответственно в 5,74 и 3,44 раза меньшей. Общий иммуноглобулиновый уровень был выше в контрольной группе в 2,47 раза по сравнению с группой павших телят. Уровень катаболизма IgG, IgМ и IgА в группе павших телят составил соответственно 24,86, 12,91 и 69,77 %. В группе выживших телят этот показатель равнялся соответственно 26,01, 60,00 и 51,69 %. Уровень катаболизма общих иммуноглобулинов в группе выживших телят был в 1,12 раза выше, чем в группе павших телят, а IgМ — в 4,64 раза. 2.2.5. Концентрация иммуноглобулинов в сыворотке крови и секрете молочной железы коров. В результате проведенных исследований установлено, что концентрация иммунных глобулинов в сыворотке крови и в секрете молочной железы имеет существенное различие (табл.2. 8; рис. 2.4). Так, содержание иммуноглобулинов различных классов значительно варьирует, особенно заметно превалирует концентрация IgG в сыворотке крови и в секрете молочной железы по сравнению с IgМ и IgА. Количественное содержание IgG в молозиве составляет 49,5±0,21 мг/мл при доверительном интервале 49,27-49,73 мг/мл, тогда как концентрация IgМ и IgА равняется соответственно 4,16±0,16 мг/мл (доверительный интервал 3,98-4,34 мг/мл) 3,93±0,28 мг/мл (доверительный интервал 3,65-4,21 мг/мл). Содержание IgG в сыворотке крови равняется 18,28±0,27 мг/мл при доверительном интервале 18,0-18,56 мг/мл, в то время как концентрация IgМ и IgА составляет 2,54±0,07 мг/мл (доверительный интервал 2,46-2,62 мг/мл) и 0,49±0,02 мг/мл (доверительный интервал 0,46-0,52).
Таблица 2.8Концентрация иммуноглобулинов в сыворотке крови исекрете молочной железы коров (n=18)
При изучении количественного содержания иммунных глобулинов в сыворотке молока установлено значительное превышение IgG (0,59±0,03 мг/мл, доверительный интервал 0,56-0,62 мг/мл) в сопоставлении с уровнем IgМ (0,05±0,01 мг/мл, доверительный интервал 0,04-0,06 мг/мл) и IgА (0,13±0,01 мг/мл, доверительный интервал 0,12-0,14 мг/мл). Процентное отношение содержания иммунных глобулинов в сыворотке крови и секрета молочной железы и общему уровню иммуноглобулинов составляет соответственно в сыворотке крови IgG — 85,78; IgМ — 11,92 и IgG — 2,3 %. В сыворотке молозива эти показатели равняются: IgG — 85,96; IgМ — 7,25; IgА — 6,82 %. Процентное отношение в сыворотке молока к общему уровню иммуноглобулинов составляли: IgG — 76,62; IgМ — 6,50; IgА — 16,88 %.
2.2.6. Содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови коров и новорожденных телят. Гуморальный иммунитет обуславливается специфическими антителами, принадлежащими к пяти классам иммуноглобулинов, основными из которых являются три: IgG, IgМ, IgА. Известно также, что в неблагополучном по инфекционным заболеваниям хозяйстве даже при наличии комплекса стрессовых факторов (нарушение условий содержания, режима кормления) часть животных не заболевают или переболевают бессимптомно, что объясняется иммунологической резистентностью животных, определяемой уровнем иммуноглобулинов. В связи с этим количественное определение отдельных классов иммуноглобулинов, как метод исследования состояния гуморального иммунитета приобретает в настоящее время особую значимость в определении иммунологической резистентности новорожденных животных. Большинство исследователей септическую форму колибактериоза телят связывают с недостаточностью иммуноглобулина М, а энтеритную — иммуноглобулинов G и А. Такую роль различных классов иммуноглобулинов следует учитывать при разработке профилактических мероприятий, диагностике и лечении. В практике большое значение имеет своевременная оценка иммунологического статуса новорожденных животных, основанная на поступлении иммуноглобулинов молозива. Для этих целей используют такие методы, как радиальная иммунодиффузия в агаре, рефрактометрия, спектрофотометрия, осаждение иммуноглобулинов сульфатом цинка или аммония и сульфитом натрия, с последующей нефелометрией или колориметрированием [R. Aschaffenburg, S. Bartlett, S. K. Kon, P. Terry, S. Y. Thompson and D. M. Walker, 1949a; R. Aschaffenburg, S. Bartlett, S. K. Kon, D. M. Walker, C. Briggs, E. Cotchin and R. Lovell, 1949b; G. Mancini, A. O. Carbonara and J.F. Heremans, 1965; В. М. Чекишев, 1977; P. Blackmer, 1973]. В результате проведенных исследований установлено, что концентрация иммуноглобулинов в сыворотке крови телят до приема молозива является незначительной и общее содержание их составляет 1,03 мг/мл. В суточном возрасте общее содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови телят в 1,38 раза меньше, чем у коров сразу после отела и составляет соответственно 16,9 и 22,3 мг/мл. По мнению многих ученых в условиях крупных ферм новорожденным телятам в суточном возрасте необходимо иметь в сыворотке крови столько иммуноглобулинов, сколько их имеется в сыворотке взрослых и если этого не обеспечить, то желудочно-кишечная патология неизбежна [B. C. Шипилов, В. П. Шишков, В. Г. Зароза, В. П. Карев, Г. Д. Смоленская, 1987]. У исследованных нами телят суточного возраста концентрация IgМ в сыворотке крови была меньшей соответственно в 1,8 и 1,7 раза, чем у коров (табл. 2.9). Незначительное увеличение количества иммуноглобулинов отдельных классов в сыворотке крови телят 2-3-дневного возраста (IgG — 15,35 мг/мл, IgМ — 1,11 мг/мл, IgА — 0,50 мг/мл и соответственно 15,84 мг/мл, 41,82 мг/мл, 0,70 мг/мл) объясняется тем, что в первые один-два дня жизни через кишечник могут проходить иммуноглобулины молозива в неизмененном виде. Увеличение концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови телят 9-10- дневного возраста происходит в связи с тем, что спустя неделю после рождения слизистая оболочка тонкого кишечника приобретает способность синтезировать собственные защитные иммуноглобулины, так называемые секреторные [D. Eddie, M. Sohulkind, I. Robbins, 1971; P. D. Porter, D. E. Noakes, and W. D. Allen, 1972].
Таблица 2.9Содержание иммунных глобулинов в сыворотке крови телят
Эти данные составляют соответственно по сравнению с 2-З-дневным, возрастом IgG — 15,84 мг/мл, IgМ — 1,82 мг/мл, IgА — 0,70 мг/мл против IgG — 16,81 мг/мл, IgМ — 2,03 мг/мл, IgА — 0,77 мг/мл. Статистическая обработка результатов определения количества иммуноглобулинов отдельных классов в сыворотке крови коров и телят представлена в таблицах 2.10; 2.11; 2.12; 2.13. Данные таблиц показывают, что относительная ошибка опытов составляет от 2,96 до 16,3 %, точность прямых измерений от 0,006 мг/мл IgА до 1,9 мг/мл IgG; средняя арифметическая ошибка определения иммуноглобулинов в сыворотке крови телят составляет: IgG от 0,0015 до 0,27; IgМ — 0,024-0,19; IgА — 0,006- 0,0048; дисперсия соответственно IgG от 0,0007 до 0,0036; IgG — 0,01-0,017; IgА — 0,01-0,06.
Таблица 2.10.Содержание иммунных глобулинов в молозиве коровпервого дня лактации (n=4)
Таблица 2.11Динамика накопления иммуноглобулина G в сывороткекрови телят (n=16).
Данные результатов определения иммуноглобулинов отдельных классов характеризуют становление гуморального иммунитета у здоровых телят. Сравнение полученных данных о содержании иммуноглобулинов и их классов в сыворотке крови новорожденных телят с имеющимся в литературе [М. И. Немченко, Т. Д. Гришина, 1983; В. М. Чекишев, В. М. Васильев, А. И. Кабанцев, 1983] свидетельствует о том, что оно минимально, то есть имеет место гипогаммаглобулинемия.
2.2.7. Уровень антител против О-антигенов Е. coli в нормальномкоровьем молозиве, молоке и сыворотке крови новорожденных телят. Телята не получают материнские антитела внутриматочно, а приобретают их из молозива, абсорбируя глобулины, через верхнюю часть тонкого кишечника [R. Aschaffenburg, S. Bartlett, S. K. Kon, D. M. Walker, C. Briggs, E. Cotchin and R. Lovell, 1949b; R. Aschaffenburg, S. Bartlett, S. K. Kon, J. M. Roy and D. M. Walker, 1951a; G. H. Stott A. Pellah, 1982; С. С. Gay, Т. McGuire, S. M. Parish, 1983]. Таблица 2.12 Динамика накопления иммуноглобулина М в сыворотке крови телят (n=16)
Значение Е. coli в патогенезе диареи новорожденных телят и исключительная важность кормления их молозивом, увеличивающем резистентность к |
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
© 2010 |
|