 |
РУБРИКИ |
Диплом: Состояние естественной резистентности и иммунологической реактивности у новорожденных телят при колибактериозе |
РЕКОМЕНДУЕМ |
||
|
Диплом: Состояние естественной резистентности и иммунологической реактивности у новорожденных телят при колибактериозетитрах и низшей частоте может постулироваться их незначительной вирулентностью и инвазивностью или тем, что антитела обладают перекрестной реакцией и не специфичны для этих серотипов. Результаты абсорбционного теста сыворотки молозива и сыворотки крови телят указывают на перекрестную абсорбцию антител против Е. coli К антигенов исследуемых серотипов. Перекрестная абсорбция была, особенно, очевидной с 2-мя типами В антигенов, так как абсорбция с 1 антигеном идентифицирует антитела против 2 антигенов (О78:К80 и О119:К69). Эти данные подтверждают значительную перекрестную реактивность антител к К-антигенам. Такая кросс-реактивность антител обеспечивает защиту неонатальных телят против инфекции с более чем 1 штаммом Е. coli . Следовательно, антитела с перекрестной активностью против К антигенов Е. coli в естественных условиях способствуют повышению резистентности неонатальных телят против различных штаммов Е. coli . Активность антител против К антигенов в молозиве и сыворотке телят 1-2 дневного возраста была более низкой чем активность против О антигенов. Низкий титр К-антител в сыворотке неонатальных телят можно было предположить, так как незначительная частота и низкий титр К-антител был в молозиве коров. В кишечнике новорожденных телят иммуноглобулины абсорбируются не селективно. Антитела против Е. coli К антигенов в молозиве были резистентные против обработки 2-меркаптоэтанолом, как и антитела в сыворотке новорожденных телят. Эти результаты указывают, что антитела не являются макроглобулинами. Различная концентрация антител (титр) в сыворотке новорожденных телят против К и О антигенов указывает, что кормление молозивом может стимулировать или подавлять синтез антител к определенным антигенам в одинаковой степени независимо от места их локализации в бактериальных клетках.
2.2.9. Протективный механизм молозива при колибактериозе новорожденныхтелят. Выявление механизма протективного действия молозива при колибактериозе новорожденных телят является определяющим фактором в прогнозировании данного заболевания. В молозиве присутствуют протективные антитела против Е. coli и низкое их содержание в отдельных образцах связано с возрастом коров [Th. Smith and R. B. Little, 1922b]. В последующем [C. Briggs, 1951], изучая антигенную структуру Е. coli , доказал, что реакция между К антигеном и антителами связана с защитой и основана на иммунологическом протективном значении молозива. Сущность протективного фактора против колибактериоза ассоциируется с лактоглобулиновой фракцией [R. Aschaffenburg, S. Bartlett, S. K. Kon, P. Terry, S. Y. Thompson and D. M. Walker, 1949a; R. Aschaffenburg, S. Bartlett, S. K. Kon, J. M. Roy and D. M. Walker, 1951a]. Молозиво от коров получали из хозяйств: «Кетросу» района Анений Ной и ОПХ «Колоница» района Криулень. Молозиво (100 мл) нагревали до 37° С и добавляли 4 мл разведенного (1:10) сычужного фермента. После отделения сыворотки (через 30-60 мин) проводили фильтрацию для освобождения от казеина. Бульонную культуру Е. coli тестировали для определения DL50 путем внутрибрюшинного заражения белых мышей. Эта доза составила 0,25 мл. Мышей заражали интраперитонально в дозе DL50 тест- микроорганизмами и через 2 ч после инъекции вводили 0,5 молозивной сыворотки в разведении 1:5-1:20 соответственно титру. Мыши были под наблюдением в течение 72 ч. в порядке дифференциации между «К» и «О» агглютинацией, суспензию готовили для тест агглютинации следующим образом: 1- живая; 2- гретая при 100°С; 3- гретая при 120°С 2 ч. В опытах использовали три серотипа Е. coli: О78:К80, 0119:К69, 0137:К79. Для протективного теста использовали 18-24 ч бульонную культуру Е. соli каждого из вышеназванных серотипов. Агглютинация («О», «К») и протективный тест на белых мышах представлены в табл. 2.24. «К» антитела, содержащиеся в молозиве и обладающие протективной активностью для белых мышей, отличались, как по титру, так и по эффекту для разных серотипов и проб сывороток молозива. Тест агглютинация против микробной суспензии, приготовленной тремя различными методами, является убедительным доказательством характеризующим высокую специфичность реакции. Данные табл. 2.24 подтверждают, что содержащиеся в молозиве антитела-агглютинины против «К» антигена Е. соli обладают высокой протективной активностью. Молозиво, содержащее антитела-агглютинины против «О» антигена обеспечивает незначительную защиту. Пробы молозивной сыворотки, не содержащие агглютинины против «К» и «О» антигенов, не обладали протективной активностью. Следовательно, протективная эффективность проб сывороток молозива против серотипов Е. соli может быть установлена определением титра «К» антител. Культура Е. соli была изолирована из крови яремной вены двух больных телят, один из которых погиб через 24 ч, а другой через 36 ч. Телятам скармливали молозиво и определяли массу тела, как у живых, так и у погибших. Из одиннадцати телят, девять получавших 400 мл молозива в первое кормление, погибали в течение двух недель. Исследованием штаммов Е. соli, изолированных от этих телят определили содержание «К» антител-агглютининов в пробах, используемого молозива. Изолированные штаммы Е. соli, выделённые из крови сердца и костного мозга при аутопсии принадлежали к серотипам О78:К80, О119:К69, О137:К79.
Таблица 2.24Титр колостральных антител и протективные свойствамолозивной сыворотки к серотипам Е. coli, изолированных от павших телят.
* летальность мышей отмечали в числителе, а количество зараженных в знаменателе. Исследованные пробы молозива различались как по титру, так и по содержанию «К» антител по отношению к исследуемым серотипам Е. соli. Так, например, проба молозива 1 не содержала «К» антител против серотипа О78:К80, проба II – против серотипа О119:К69, проба III – против серотипов О78:280; О137:К79. Доказательством взаимосвязи между защитой телят молозивом и присутствием в том же самом молозиве антител- агглютининов против «К» антигенов, в частности, к исследуемым серотипам Е. соli подтверждается протективным действием молозива – как результат специфической активности. Так как, «К» антитела-агглютинины в молозиве являются фактором, защищающим белых мышей против экспериментального колибактериоза, эффективность проб молозива против определенных серотипов Е. coli можно тестировать агглютинационным методом. Следовательно, энзоотия колибактериоза новорожденных телят объясняется дефицитом агглютининов против «К» антигена Е. coli . Молозиво, скармливаемое телятам, погибшим от энзоотического колибактериоза, не содержало антител агглютининов против «К» антигенов Е. coli , изолированных от павших телят. Таким образом, протективный механизм молозива является в значительной степени иммунологическим и ассоциируется с антителами против «К» антигенов Е. coli , вызывающих колибактериоз неонатальных телят. 2.2.10. Факторы, влияющие на выживание новорожденных телят. Успешное выращивание новорожденных телят зависит от целого ряда факторов, в том числе от своевременного скармливания молозива в достаточном количестве, а также от состояния молочной железы коровы, умения и мастерства обслуживающего персонала. Ущерб на отдельных фермах республики был в диапазоне от 10 до 80 % и часто отражал организацию содержания и кормления [А. В. Драгомир, Е. А. Драгомир, А. Ф. Карышева, Ф. В. Спатарь, 1985]. Однако наиболее важным фактором, влияющим на выращивание новорожденных телят, является абсорбция колостральных антител в соответствующем физиологическом количестве. Молозиво здоровых коров — наиболее сильнодействующее лекарственное средство для телят. Оно обеспечивает большую защиту новорожденных, чем фармацевтика [V.C.R. Irvin, 1974]. Это было доказано в большинстве случаев, когда выживание телят в значительной степени зависело от адекватного поглощения молозива и абсорбции. Летальность среди телят, лишенных молозива, достигала 70-90 % с наибольшим падежом от эшерихиоза или пастереллезной пневмонии. Несмотря на то, что новорожденные телята иммунокомпетентные при рождении, они не способны быстро анамнестически реагировать, то есть подвергать действию лимфоцитов определенным антигенным повторным воздействиям. Поэтому несколько дней необходимо телятам для установления иммунологической реактивности и продуцирования иммуноглобулинов. В этот лаг-период (промежуток времени между раздражением и ответной реакцией) телята остаются иммунологически незащищенными и восприимчивыми к патогенным микроорганизмам. Следовательно, здоровье телят зависит от поглощения и абсорбции колостральных иммуноглобулинов, обеспечивающих максимальную резистентность от инфекционных заболеваний в течение первой недели жизни [T.C. McGuire, D.S. Adams, 1982]. Известно, что телята способные абсорбировать иммуноглобулины наиболее эффективно в течение первых 8 ч после рождения с незначительным снижением уровня в течение 24 ч. Это происходит в результате «закрытия» интестинального эпителия и прекращения активного транспортного механизма [G. H. Stott, D. B. Marx, B. E. Menefel and G. T. Nightengale, 1979]. Кроме того, иммуноглобулиновый уровень у коров снижается быстро после родов, в течение первых трех дней. Поэтому необходимость раннего поглощения молозива является неотъемлемым элементом системы выращивания телят. Новорожденные телята очень лимитированы гликогеном (животный крахмал), который накапливается в печени. Он должен использоваться как адекватный источник энергии после рождения для поддержания позитивного энергетического уровня. Высокий уровень циркуляции в крови телят молозива перед рождением до некоторой степени обеспечивает глюконеогенез (образование глюкозы из протеина и жира) в первые 12 ч. Молозиво превосходный источник энергии, протеина, витаминов А и D, комплекса витаминов В, а также кальция, фосфора, магния и хлоридов. В наших исследованиях (учхоз «Кетросу» района Анений Ной, ОПХ «Колоница») 26,6 % (4/15) телят, лишенных молозива, выживали, в то время как ни один теленок, кормившийся молозивом не погиб. На фермах применялось стандартное лечение, включая заменитель молока с электролитным раствором 3 дня и более и последующие 2 дня реадаптации — заменитель молока, когда диарея была корректирована (нейтрализована). Антибиотики орально не применяли для того, чтобы не уничтожить нормальную бактериальную популяцию и не вызвать фунгальный (грибной) гастроэнтерит. Значительная перегрузка организма телят антибиотиками может содействовать повышению восприимчивости к фунгальной инфекции, не поддающейся лечению[М. А. Сидоров, 1981; У. Риихикоски, 1986]. 2.2.11. Клиническая оценка эффективности вакцинации коров для профилактики колибактериоза телят. Колибактериоз телят относится к числу широко распространенных инфекционных болезней молодняка и регистрируется во всех развитых странах. Наиболее ощутимый ущерб он наносит в животноводческих комплексах за счет высокой смертности, отставания в росте и снижения продуктивности переболевших животных. Одним из основных предрасполагающих факторов колибактериоза является агамма- или гипогаммаглобулинемия, обусловленные неполноценностью молозива полученного и скармливаемого несвоевременно новорожденным в условиях снижающих резистентность макроорганизма [Ю. А. Малахов, О. А. Тугаринов, М. К. Пирожков, Т. И. Исхакова, 1993]. Заболевание телят колибактериозом на 2-5 дни жизни вынуждает вакцинировать против эшерихиоза стельных коров для создания невосприимчивости у нарождающегося молодняка. Против колибактериоза вакцинируют животных во всех развитых странах. Первые вакцины колибактериоза телят начали применять в 40-х годах. Они представляли инактивированную микробную суспензию штаммов кишечной палочки, выделенных от больных или павших животных и использовались в хозяйствах различных регионов с незначительной эффективностью. Для профилактики колибактериоза в настоящее время применяют поливалентную гидрооксиалюминевую формол-тиомерсаловую вакцину против колибактериоза (эшерихиоза) поросят, телят и ягнят. Изготовляют два варианта: Вакцина против колибактериоза поросят: О8:К43, О9:К30, О78:К80, О138:К81, О139:К82, О141:К85:К88, О147:К87:К88, О149:К91:К88. Вакцина против колибактериоза телят и ягнят: О8:К43, О9:К30, О15:К14, :К30, О20, О26:К60, О41, О55, О78:К80, О86:К61, О115, О117:К62, О119:К69, О101:К99. На фоне применения данной вакцины мы предусмотрели: 1. Установить серотиповую принадлежность эшерихий, выделенных от больных и павших телят. 2. Определить уровень антител, приобретенный телятами в результате вакцинации стельных коров в сыворотке молозива и сыворотке крови телят против выделенных серотипов кишечной палочки. 3. Разработать экспресс-метод для индикации «К» антител в колостральной сыворотке коров и сыворотке крови новорожденных телят. Для выделения культур Е. coli отбирали патологический материал от павших телят, а от больных фецес, из хозяйств неблагополучных по колибактериозу, Культуры выделяли и идентифицировали в соответствии с «Методическими рекомендациями по бактериологической диагностике колибактериоза» (1981; 1991). Принадлежность исследуемых культур Е. coli к О серогруппам устанавливали в РА с типоспецифическими О колисыворотками согласно наставлению по их применению. Способность Е. coli образовывать фимбриальные адгезины определяли в капельной РА с моноспецифическими антиадгезивными сыворотками К99, F41, Аtt25, 987Р, К88 ав, К88 ас, К88 аd.[О. А. Полякова, Н. И. Евглевская, Н. А. Соколова, 1986]. Вакцинацию стельных коров проводили «Поливалентной гидроокисиалюминиевой формол-тиомерсаловой вакциной против колибактериоза (эшерихиоза) телят и ягнят согласно наставлению по ее применению. Пробы фецес разводили стерильным физиологическим раствором 1:100, затем пастеровской пипеткой засевали две капли взвеси кала, культивировали на 5 %-ном кровяном агаре, Мак Конки агаре, средах Эндо и Левина при 37°С 18 ч. Е. coli пересевали со сред Эндо и Левина на МПА и МПБ. Полученные агаровые и бульонные культуры выдерживали в темном месте при комнатной температуре для дальнейшего исследования и серотипизации. Для бактериологического исследования отбирали следующий материал от падших телят: сычуг, верхний отрезок тощей кишки, нижний отрезок тощей кишки, части подвздошной, слепой кишки, мезентеральные лимфатические узлы, печень, селезенку и почки. Пробы отбирали также из других мест, таких как суставы, головной мозг, пуповина и легкие, если клинически и патологоанатомически выявляли аномалии в них. Пробы отбирали, избегая контаминации и культивировали на 5 %-ном кровяном агаре и Мак Конки агаре. Пробы подвздошной кишки и селезенки культивировали на среде Левина. Засеянные пробирки и чашки Петри инкубировали при обычной атмосфере (аэробные условия) при 37°С 18 ч. Три колонии из преобладающих типичных колоний Е. coli были пересеяны дополнительно на среды с углеводами (глюкоза, лактоза, сахароза, манит и др.). Пробирки инкубировали при 37° С 18 ч. Критериями для установления диагноза на колибактериоз были: клиническое и патологоанатомические исследования, отличающиеся от других случаев диареи и гибели телят и которые ассоциировались со следующими бактериологическими данными: a) большое количество Е. coli в верхнем отрезке кишечника и региональных лимфатических узлах, а также в других интестинальных органах; b) отсутствие других патогенных бактерий, поражающих телят. 2.2.11.1. Определение «О» антигена. Выделенные культуры классифицировали серологически в порядке сравнения с серотипами, применяемыми при вакцинации. Культуру в начале тестировали пластинчатой реакцией агглютинации на предметном стекле, 18-часовую культуру из плотной питательной среды (МПА) смывали физиологическим раствором и полученную суспензию использовали как антиген. Эту суспензию нагревали при 100° С один час для инактивирования В и L типов «К» антигена и тестировали, смешивая одну каплю антигена с одной каплей соответствующей «О» сыворотки на зеркальном стекле, размещая его над водяной баней при 60° С. Результаты учитывали через 10 мин после смешивания. Позитивную реакцию подтверждали пробирочной агглютинацией, применяя формалинизированную шестичасовую культуру в МПБ. 2.2.11.2. Определение «К» антигена. Культуру вначале тестировали пластинчатой реакцией агглютинации на предметном стекле. Одну каплю живой суспензии культуры смешивали с одной каплей различных антисывороток. Результаты учитывали в течение 30 секунд после смешивания. Позитивную агглютинацию подтверждали пробирочной агглютинацией до титра тест сыворотки, применяя как антиген живую пятичасовую культуру в МПБ. Пробирки инкубировали при 37° С два часа, в последующем агглютинационные пробирки центрифугировали при 2000 об/мин в течение трех минут. Одинаковый диск агглютинации учитывали как позитивную реакцию. Эффективность вакцинации коров, предназначенную для профилактики колибактериоза телят определяли в двух хозяйствах. Проведенная серологическая типизация выделенных культур Е. coli от павших телят, родившихся от вакцинированных коров, свидетельствует, что, как правило, серологическая принадлежность в сравнении с вакцинными серотипами имеет существенное различие (табл. 2.25).
Таблица 2.25Данные серологической типизации по «О» антигену Е. coli
* числитель — типируемые; знаменатель — нетипируемые. Из 12 родившихся телят в октябре-декабре 1993 года семь были от вакцинированных коров, и пять от невакцинированных. У четырех телят из пяти от невакцинированных коров наблюдали диарею и из них два погибли. Из семи телят от вакцинированных коров пять заболели на 2-3-й день жизни, три из них погибли. Нетипируемые штаммы Е. coli . были обнаружены во всех уровнях кишечника за исключением внутренних органов. Кроме того, нетипируемые штаммы Е. coli выделяли из фекальных проб телят вначале диареи. Из других органов (печень, селезенка) выделяли штаммы Е. coli обладающие «О» групповым антигеном, принадлежащими к серотипам О101; О8.
Таблица 2.26Результаты серологической типизации по «К» антигену Е. coli
У выделенных от телят Е. coli обнаруживали фимбрии К99, К88ас. (табл. 2.26). При анализе О серогрупповой принадлежности исследуемых культур и способности экспрессировать фимбрии установили взаимозависимость. Так, фимбрии обнаруживали у выделенных от телят штаммов Е. coli относящихся к серотипам О8 и О101. Уровень антител молозива, полученного от вакцинированных коров и уровень антител сыворотки крови телят от этих коров представлены в табл. 2.27; 2.28.
Таблица 2.27Титр антител в молозиве коров и сыворотке крови телят(серотип О8) Е. coli
* сыворотка молозива первого дня после отела. ** теленок пал или выздоровел. *** обратная величина дроби.
Таблица 2.28Титр антител в молозиве коров и сыворотке крови телят(серотип О101) Е. coli
Данные таблицы подтверждают, что вакцинация стельных коров не ингибирует серотипы Е. coli входящие в состав вакцины. Прекращение вспышек колибактериоза связано с другими факторам. В наших исследованиях мы установили, что колибактериоз телят вызывался двумя серотипами Е. coli О8 и О101. Более ранние наблюдения [A. Dam, 1971; H. Fey, 1971a] в других странах также указывают, что более чем один серотип Е. coli может быть изолирован при заболевании телят колибактериозом. Известно, что «К» антитела играют важную роль в защите лабораторных животных против экспериментальной Е. coli инфекции [R. K. Braun, B. C. Tennant, 1983]. Большинство тестированных телят в наших исследованиях не обладали «К» антителами к Е. coli штаммов изолированных при заболевании телят колибактериозом.
ВЫВОДЫ· Содержание колостральных иммуноглобулинов в сыворотке крови телят отражает уровень резистентности животных. · Концентрация иммунных глобулинов в молозиве в течение первых трех дней лактации снижается последовательно в 2,16 раза на второй день и в 4,93 раза на третий – по сравнению с первым днем. · Уменьшение абсорбции колостральных иммуноглобулинов в 1,23 и в 1,45 раза по сравнению с контрольной группой (здоровые) животных способствует возникновению соответственно энтеритной и септической формы колибактериоза. · Угасание абсорбции колостральный антител происходит в следующей последовательности IgG, IgM и IgA. · Количественное содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови и в сыворотке коров имеет существенное различие. · Активность антител против К-антигенов в молозиве коров и в сыворотке крови телят 1-2-дневного возраста была меньшей, чем активность против О-антигенов Е. coli. · Различная концентрация антител (титр) в сыворотке новорожденных телят против О и К-антигенов Е. coli указывает, что кормление молозивом может стимулировать или подавлять синтез антител к определенным антигенам в одинаковой степени независимо от места их локализации в бактериальных клетках. · Протективный механизм является иммунологическим фактором и коррелирует с уровнем иммуноглобулинов против К-антигенов Е. coli и возникновением колибактериоза телят. · Иммунизация стельных коров поливалентной гидроокисьалюминиеной формол-тиомерсаловой вакциной против колибактериоза телят не ингибирует серотипы Е. coli 08 и 0101, входящие в состав вакцины и выделенные от павших телят. РАЗДЕЛ 3 ИЗУЧЕНИЕ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ РЕАКТИВНОСТИ НОВОРОЖДЕННЫХ ТЕЛяТ 3.1.Биохимический анализ крови новорожденных телят В опытах использовали 30 телят. Их возраст в период исследования был от 2 до 10 дней. Кровь брали из яремной вены для определения следующих показателей: рН; СО2 (Hg mm); О2 (Нg mm); НСО3 (m Eg/I); N+ (m Еg/I); K+ (m Eg/I-); Cl‑ (m Eg/I); Гематокрит (%); Мочевина (mg/dl); Неорганический фосфор (mg/dl); Общий белой (g/dl). Анализ этих показателей проводили дважды в день. В порядке изучения отклонений учитывали два условия: выживание и смерть телят. Это состояние определяли функцией учтенных параметров как максимум различий, выступающий между двумя группами. Характеристика 2-х показателей приведена в табл. 3.1; 3.2; 3.3. Данные таблиц показывают, что некомпенсированный метаболический ацидоз всегда присутствует. Дегидратация отмечается при высоком гематокрите. Корреляционные табл. 3.1 и 3.2 между основными показателями указывают, что определенные параметры имеют очень сходное поведение (например, 1 и 4 бикарбонатная концентрация изменяется непосредственно в зависимости от рН крови, феномен — хорошо известный). На другие параметры передается их обратная связь, как например, частичное соприкосновение с противоположной связью СО 2 и О2. Корреляционная матрица (табл. 3.3-3.5) показывает на сопротивление между парциальным давлением О2 в венозной крови и показателями кислотно-щелочного равновесия, в частности парциального давления СО2 в порядке нейтрализации метаболического ацидоза в нормальном противодействии уменьшающим парциальное давление СО2. Следовательно, снижение парциального давления СО2 указывает на уменьшение количества О2 в тканях. Группа результатов подтверждает, что некомпенсированный метаболический ацидоз вызывает диарею у телят. Существует связь между кислотно-щелочным равновесием и катаболизмом. Вероятно, что катаболизм, который имеет место при диарее, практически выражает плохо функционирующие физиологические механизмы. Кислотность убывает в основном, с фецес и это состояние прямое следствие диареи. Моделью определения основных показателей является математическая обработка сравнимых данных, полученных в этом исследовании. При статистической обработки результатов исследовании с применением ЭВМ «НАИРИ» крови новорожденных телят, установлено, что использование трех показателей легко измеряемых величин (мочевина, гематокрит, хлориды) позволяет прогнозировать с вероятной точностью до 78% возникновения заболевания и, следовательно, лечить с применением регидратационной терапии, возмещением кислотности и потери ионов натрия. Некомпенсированный метаболический ацидоз – основной признак при диареи телят. Установлена связь между кислотно-щелочным равновесием и катаболизмом. Возможно, что катаболизм отражает плохо функционирующие физиологические механизмы, воздействующие на причинный агент (бактерии, вирусы). Данные исследования показывают, что выжившие телята имеют преимущество в количественном отношении изучаемых величин перед павшими животными. Концентрация калия (мера катаболизма) имеет тенденцию к увеличению, в то время как концентрация натрия в крови уменьшается (табл. 3.6-3.7).
Таблица 3.3Корреляционная матрица биохимических показателей нормальное значение
Таблица 3.4Корреляционная матрица между изучаемыми отклонениями(выжившие телята)
Таблица 3.5Корреляционная матрица между изучаемыми отклонениями (павшие телята)
|
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
© 2010 |
|