: Литература - Другое (книга по генетике)

: Литература - Другое (книга по генетике)

ВВЕДЕНИЕ

Если век Х1Х по-праву вошел в историю мировой цивилиза-

ции, как Век Физики, то стремительно завершающемуся веку ХХ,

в котором нам посчастливилось жить, по всей вероятности, уго-

товано место Века Биологии, а может быть и Века Генетики.

Действительно, за неполных 100 лет после вторичного открытия

законов Г. Менделя генетика прошла триумфальный путь от на-

турфилософского понимания законов наследствености и изменчи-

вости, через экспериментальное накопление фактов формальной

генетики к молекулярно-биологическому пониманию сущности ге-

на, его структуры и функции. От теоретических построений о

гене как абстрактной единице наследственности к пониманию его

материальной природы как фрагмента молекулы ДНК, кодирующей

аминокислотную структуру белка, до клонирования индивидуаль-

ных генов, создания подробных генетических карт человека и

животных, идентификации генов, мутации которых сопряжены с

тяжелыми наследственными недугами, разработки методов биотех-

нологии и генной инженерии, позволяющих направленно получать

организмы с заданными наследственными признаками, а также

проводить направленную коррекцию мутантных генов человека, то

есть генотерапию наследственных заболеваний. Молекулярная ге-

нетика значительно углубила наши представления о сущности

жизни, эволюции живой природы, структурно-функциональных ме-

ханизмах регуляции индивидуального развития. Благодаря её

успехам начато решение глобальных проблем человечества, свя-

занных с охраной его генофонда.

Естественно, что возможность манипуляции с индивидуаль-

ными генами человека и животных еще недостаточна для понима-

ния функции всего генома, его организации вцелом, взаимо-

действия его частей в обеспечении всего многообразия механиз-

мов онтогенеза, то есть развития одной клетки до целого орга-

низма. Если добавить к этому, что в геноме любого вида за-

писана не только программа индивидуального развития, но зако-

дирована и вся эволюция вида, то есть его филогенез, стано-

вится понятным насколько логичной и методически своевременной

явилась Международная научная программа "Геном человека". На-

ряду с аналогичными программами для других видов (лаборатор-

ные мыши, нематоды) программа Геном человека, начатая около

10 лет назад, уже к 2 000 году позволит полностью расшифро-

вать первичную структуру ДНК, то есть идентифицировать все

гены человека, их регуляторные элементы. Захватыающая Одиссея

о наследственности, которой и является эта программа, безмер-

но расширит наши представления о структуре и функции генома,

его эволюции, откроет горизонты столь увлекательного, а, воз-

можно, и не менее опасного направленного воздействия человека

на геном растений, животных и, что особенно рискованно, на

свой собственный геном. Важно осознать, что это не завтрешний

день фундаментальной науки, не отдаленные абстракции, но день

сегоднешний. Он уже наступил и стал реальным независимо от

нас, и, если не быть к нему готовым концептуально и методи-

чески, то пройдет помимо нас.

Предлгаемая вашему вниманию книга, действительно,

представляет собой введение в молекулярную генетику

наследственных болезней и рассчитана на достаточно широкую

аудиторию медиков и биологов. Для большинства из уже состояв-

шихся специалистов в этих областях - это реальная возможность

для самообразования, которой, увы, с годами мы так часто пре-

небрегаем, запутавшись в повседневных заботах. Для студентов

биофаков и особенно для студентов-медиков - эта книга вполне

может рассматриваться в качестве учебного пособия по молеку-

лярным основам медицинской генетики. Однако, и для первых и

для вторых, по глубокому убеждению авторов, много лет отдав-

ших внедрению достижений молекулярной биологии в медицинскуюя

практику, книга может служить в качестве справочного руко-

водства по молекулярной генетике человека. Действительно, ни

одна клиническая дисциплина (за исключением, может быть,

службы организации здравоохранения) не мыслима сегодня без

знаний и определенных навыков по молекулярной генетике. Ни

один биолог, занятый вопросами наследственности, изменчи-

вости, онтогенеза или эволюции независимо от конкретного био-

логического объекта, не может игнорировать человека, как од-

ного из пока немногих биологических видов с полностью

расшифрованной структурой генома. Быстро набирающая силы мо-

лекулярная медицина, преподование азов которой все еще явно

недостаточно для будущих врачей, на самом деле представляет

собой принципиально новый качественный уровень в понимании

вопросов этиологии, патогенеза, а, следовательно, и лечения

многих болезней, как наследственной моногенной, так и муль-

тифакториальной природы.

По нашему мнению, не только современный врач и специа-

лист-биолог, но и каждый образованный человек сегодня должен

знать о триумфе Международного Научного Сообщества в выполне-

нии программы Геном человека, в результате которой успешно

расшифровываются все гены человека, каждый из которых, будучи

выделенным из организма и проклонированным может выступать в

качестве лечебного препарата для генотерапии. О том, что уже

сегодня идентифицировано на генетических картах более 5 000

структурных генов и свыше 60 000 пока неизвестных смысловых и

анонимных ДНК последовательностей. О том, что всего за 5 лет

после первых успешных попыток введения чужеродных маркерных

генов в клетки человека in vivo, число уже одобренных для

клинических испытаний программ по генной терапии наследствен-

ных заболеваний достигло более 100! Эти итоги представляются

особенно впечетляющими если учесть, что согласно данным Все-

мирной Организации Здравоохранения около 2,4% всех новорож-

денных на земном шаре страдает теми или иными наследственными

нарушениями; около 40% ранней младенческой смертности и инва-

лидности с детства обусловлены наследственной патологи-

ей. Нельзя не упомянуть о реальных достижениях молекулярной

генетики в расшифровке наследственных факторов таких бичей

человечества как ишемия сердца, атеросклероз, диабет, онколо-

гические и инфекционные заболевания. Адекватно воспринимать

происходящую на наших глазах революцию в биологии и в медици-

не, уметь воспользоваться её заманчивыми плодами и избежать

опасных для человечества соблазнов - вот что необходимо се-

годня и врачам, и биологам, и представителям других смежных

специальностей, и просто образованному человеку.

Именно эта цель, эта сверхзадача, поставлена перед дан-

ной монографией, восполняющей, по мнению авторов, наметив-

шийся в отечественной научной литературе пробел в области мо-

лекулярных аспектов медицинской генетики и генетики человека.

Отдельные обзоры, монографии (Шишкин, Калинин, 1993), пере-

водная литература по молекулярной биологии и даже обстоятель-

ные сводки, подводящие ежегодные итоги работ по программе

"Геном человека" достаточно фрагментарны и касаются лишь от-

дельных аспектов проблем генодиагностики и генотера-

пии. Рассчитаны преимущественно на специалистов по молекуляр-

ной биологии. Задача данной монографии не только осветить

современное положение дел в молекулярной диагностике и лече-

нии наследственных болезней методами генной терапии, но,

главным образом, подготовить читателей, прежде всего врачей и

биологов, к пониманию и восприятию этой методически и концеп-

туально достаточно сложной обасти генетики.

Для достижения поставленной цели нам представлялось ло-

гичным начать изложение материала с описания структуры и сов-

ременных методов анализа ДНК, с общих представлений о её кло-

нировании, секвенировании, геномных библитеках (Глава I).

Глава II полностью посвящена структуре генома человека, новой

трактовке понятия "ген", генным семействам, вариабильным

структурам генома. Генетические карты, принципы их построе-

ния, функциональное и позиционное картирование, молекулярные

маркеры, современные достижения в разработке физических и

хромосомных карт человека и в картировании генов, ответствен-

ных за наследственные заболевания рассмотрены в Главе III.

Глава IV целиком посвящена описанию молекулярных методов де-

текции как уже известных мутационных изменений в структурных

генах, так и методов сканирования предполагаемых мутаций оп-

ределенных генов. Описание прямых методов идентификации му-

таций дополнены косвенными методами, основанными на молеку-

лярном маркировании мутантных генов. Все эти методы, как

прямые, так и косвенные, составляют основу молекулярной ди-

агностики моногенных наследственных болезней, широко исполь-

зуются в генетике человека при построении генетических карт,

исследовании проблем филогенеза, в популяционной гентике и в

геномной дактилоскопии, то есть для идентификации личности.

Подробному анализу внутренних (эндогенных) факторов мутаге-

неза, а также принципам популяционного анализа мутаций

посвящена Главе Y. Основные подходы, используемые при изуче-

нии экспрессии генов в модельных бесклеточных системах, на

уровне отдельных клеток и целых организмов приведены в Главе

VI. Принципы молекулярной диагностики наследственных болез-

ней и, в частности, пренатальной диагностики, а также осо-

бенности выявления гетерозиготного носительства в семьях

выского риска, изложены в Главе VII. Небольшая по размеру,

но важная также и для понимания принципов генной терапии

Глава VIII касается искусственного создания генетических мо-

делей наследственных заболеваний, в частности на базе

трансгенных живоных. Описаны используемые при этом методы

направленного переноса чужеродных генов в эукариотические

системы. В Главе IX изложены основы генотерапии наследствен-

ных заболеваний, рассмотрены методы доставки чужеродной ДНК

в клетки человека in vitro и in vivo, преимущества и не-

достатки существующих векторных систем (физических, хими-

ческих и биологических), их конструирование, преспективы

создания "идеальных" векторных систем. Кратко рассмотрены

итоги уже проведенных испытаний по генотерапии тех заболева-

ний, для которых Программы клинических испытаний уже одобре-

ны или находятся на стадии эксперимента. В заключительной

главе (Глава X) мы посчитали целесообразным подвести некото-

рые итоги и более подробно рассмотреть молекулярную диаг-

ностику трех групп наследственных заболеваний: (1) достаточ-

но полно изученную группу лизосомных болезней накопления;

(2) болезни экспансии (преимущественно нейродегенеративные

заболевания), вызываемые совершенно новым ранее неизвестным

типом так называемых "динамических" мутаций и (3) наиболее

частые, социально значимые наследственные заболевания, по

пренатальной диагностике которых молекулярными методами уже

накоплен достаточно большой опыт в нашей лаборатории и в

других медико-генетических центрах России.

Итак, предлагаемая монография рассчитана на достаточно

широкий круг читателей, но, прежде всего, на медиков и биоло-

гов, а также специалистов смежных профессий. Нам хотелось бы

думать, что книга будет особенно полезной для студентов меди-

цинских институтов и академий, врачей курсов повышения квали-

фикации, сотрудников медико-генетических консультаций и цент-

ров, а также для студетнов-биологов, многие из которых, как

показывает наш опыт, пополняют ряды специализированных диаг-

ностических лабораторий, медико-генетических центров и инсти-

тутов.

ГЛАВА III

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ КАРТЫ, ПОЗИЦИОННОЕ КЛОНИРОВАНИЕ.

Раздел 3.1 Классификация генетических карт, оценка

сцепления.

Генетические карты определяют хромосомную принадлеж-

ность и взаимное расположение различных компонентов генома

относительно друг друга. Возможность построения таких карт

обусловлена двумя фундаментальными характеристиками генома:

линейным характером локализации генов в хромосомах (это оп-

ределяется линейностью молекулы ДНК) и относительной ста-

бильностью расположения облигатных элементов генома в преде-

лах вида. При построении генетических карт используют разные

подходы. В первую очередь, к ним относятся анализ генети-

ческого сцепления на основе определения частот мейотической

рекомбинации в информативных семьях и изучение особенностей

наследования признаков, сцепленных с маркерными хромосомными

перестройками. Во-вторых, исследование экспрессии генов или

поиск специфических последовательностей ДНК в клеточных гиб-

ридах, содержащих лишь часть генома человека - одну или

несколько хромосом или их фрагменты. В ряде случаев с этой

целью используют механический сортинг целых хромосом и даже

их относительно небольших участковв. Эти приемы позволяют

привязать картируемый ген к определенной хромосоме и даже к

определенному фрагменту хромосомы. С помощью комплекса весь-

ма тонких методов хромосомного анализа, прежде всего, мето-

дов гибридизации in situ (см. Главу I) удается картировать

отдельные гены на хромосомах человека часто с точностью до

одного бэнда. И, наконец, методами молекулярного анализа

осуществляют физическое картирование последовательностей

ДНК, локализованных в специфических участках хромосом. Затем

проводят идентификацию в этих последовательностях транскри-

бируемых областей, то есть генов, с последующей изоляцией и

клонированием соответствующих им полноразмерных молекул

кДНК. Каждый из рассмотренных этапов анализа структуры гено-

ма завершается построением карт генов, различающихся по еди-

ницам измерения расстояний между отдельными элементами этих

карт, масштабам, по насыщенности или степени детализации на

различных участках генома. Соответственно различают карты

сцепления, генетические карты, цитогенетические карты инди-

видуальных хромосом и физические или молекулярные карты оп-

ределенных участков ДНК. Для полной молекулярной идентифика-

ции отдельных элементов генома, то есть определения их гра-

ниц, структуры и нуклеотидной последовательности, необходимо

совмещение всех типов карт в местах локализации этих элемен-

тов.

Первым шагом на пути построения генетических карт явля-

ется формирование групп сцепления генов, контролирующих

различные наследственные признаки, и исследование их взаим-

ного расположения в этих группах. На следующем этапе опре-

деляют соответствие между генетическими группами сцепления

и цитогенетически идентифицируемыми хромосомами или их

фрагментами. Цитогенетическую идентификацию хромосом прово-

дят с использованием методов дифференциальной окраски

(см.раздел 3.2). По мере появления все большего числа лока-

лизованных признаков эффективность построения генетических

карт значительно возрастает, так как увеличивается число

маркированных участков хромосом и, таким образом, появля-

ется возможность комбинированного использования различных

экспериментальных подходов для более подробного исследова-

ния этих участков.

Принципиальная схема картирования неизвестных генов,

представленная на Рис.3.1, включает следующие этапы. 1. Вы-

яснение группы сцепления; 2. Поиск ближайших фланкирующих

маркеров; 3. Определение физической области (ДНК-последова-

тельности), включающей искомый ген; 4. Клонирование набора

фрагментов ДНК, перекрывающих исследуемую область; 5. Выде-

ление из этого набора клонов, содержащих транскрибируемые

ДНК-последовательности, предположительно соответствующие

гену или его фрагменту; 6. Анализ специфических мРНК и кло-

нирование кДНК-последовательности; 7. Секвенирование и

идентификация самого гена (Wicking, Williamson, 1991).

Рассмотрим подробнее эту схему.

Построение карт сцепления основано на изучении про-

цессов расхождения и рекомбинации гомологичных хромосом в

мейозе. Генетические признаки, локализованные в разных хро-

мосомах, не сцеплены друг с другом, то есть передаются от

родителей детям независимо, и частота их рекомбинации (Q)

составляет 0.5. Это обусловлено случайным характером

расхождения гомологичных хромосом в мейозе во время редук-

ционного деления. Гены, локализованные в одной хромосоме,

рекомбинируют за счет кроссинговера, то есть за счет обмена

участками гомологичных хромосом в процессе их спаривания в

мейозе (Рис.3.2). При этом порядок генов не нарушается, но

в потомстве могут появиться новые комбинации родительских

аллелей. Вероятность кроссинговера между двумя генами за-

висит от расстояния между ними. Чем ближе гены расположены

друг к другу, то есть чем больше они сцеплены, тем эта ве-

роятность меньше.

Оценку сцепления между генами проводят на основании

статистического анализа сегрегации признаков в семьях с

разветвленными родословными. Чаще всего при этом используют

метод максимального правдоподобия (Kao, 1983), то есть

подсчитывают десятичный логарифм шансов - lod (log of the

odds), где шансы (odds) выражаются как отношение вероят-

ности наблюдаемой родословной при условии, что два гена

сцеплены (0 < Q < 0.5), к той же вероятности при отсутствии

сцепления (Q = 0.5). Если значение lod > +3, гены локализо-

ваны в одной хромосоме, причем максимально правдоподобная

оценка соответствует максимальному значению lod. При значе-

ниях lod < -2 гены не сцеплены, то есть локализованы в раз-

ных хромосомах или на разных концах одной хромосомы. Ста-

тистическую обработку родословных обычно проводят с помощью

компьютерных программ, наиболее известные из которых прог-

раммы LIPED, CRIMAP и LINKAGE (Ott, 1985; Ott, 1991;

Terwilliger, Ott, 1994). На генетических картах сцепления

расстояние между генами определяется в сантиморганах (сМ).

1 сМ соответствует 1% рекомбинации. Общая длина генома че-

ловека в этих единицах составляет около 3300 сМ. Сопостав-

ляя эту величину с размером гаплоидного набора молекул ДНК,

можно заключить, что 1 сМ приблизительно эквивалентен 1

миллиону пар нуклеотидов. Такие расчеты, однако, весьма

приблизительны, так как частоты рекомбинации, а значит и

реальная длина одного сМ, могут сильно варьировать в раз-

личных частях генома. Существуют, так называемые, горячие

точки рекомбинации, также как и районы генома, где рекомби-

нация подавлена (центромерные и теломерные участки хро-

мосом, блоки конститутивного гетерохроматина и др.). Из-

вестно также, что частота рекомбинации у мужчин меньше, чем

у женщин, так что общая длина мужского генома, измеренная в

единицах рекомбинации, составляет лишь 3000 сМ. Таким обра-

зом, генетическое расстояние может дать лишь весьма ориен-

тировочную информацию о физическом (реальном) расстоянии,

выражаемом в парах нуклеотидов.

Раздел 3.2 Соматическая гибридизация, цитогенетический

анализ, картирование анонимных последова-

тельностей ДНК.

До начала 70-ых годов построение генетических карт че-

ловека продвигалось очень медленными темпами. Небольшой раз-

мер семей, длительный период одного поколения, ограниченное

число информативных родословных и отсутствие методов эффек-

тивного цитогенетического анализа всех пар хромосом затруд-

няло целенаправленное картирование генов человека. Достаточ-

но сказать, что 1-й ген человека - ген цветной слепоты был

картирован на Х-хромосоме в 1911г., а 1-й аутосомный ген-

только в 1968г. К 1973г. на хромосомах человека было карти-

ровано всего 64 гена, а к 1994 на генетических картах чело-

века было локализовано уже свыше 60 000 маркерных ДНК

последовательностей, в том числе около 5 000 структурных

генов - Рис.3.3. Столь стремительный прогресс в картирова-

нии генов человека связан с появлением новых технологий в

цитогенетике, в клеточных культурах и особенно в молекуляр-

ной генетике.

Техника соматической гибридизации, то есть возможность

экспериментального конструирования способных к размножению

межвидовых клеточных гибридов, явилась одним из наиболее

мощных инструментов для нахождения связей между группами

сцепления и цитогенетически идентифицируемыми хромосомами и

даже их отдельными сегментами. Гибридные клоны получают пу-

тем искусственного слияния культивируемых соматических кле-

ток разных видов, в частности, клеток человека и различных

грызунов - китайского хомячка, мыши, крысы (Шея,1985).

Культивирование таких соматических гибридов, как оказалось,

сопровождается утратой хромосом человека. Так были получены

панели гибридных клеточных клонов, содержащих всего одну

или несколько хромосом человека и полный набор хромосом

другого вида. Обнаружение человеческих белков, специфи-

ческих мРНК или последовательностей ДНК в таких клонах поз-

воляет однозначно определить хромосомную принадлежность

соответствующих генов. Таким способом удалось локализовать

более 250 аутосомных генов человека (Kao, 1983).

Дальнейший прогресс в области генетического картирова-

ния в значительной степени ассоциируется с деятельностью

многих научно-исследовательских центров и лабораторий по

созданию банков клеточных культур, представляющих наиболее

интересные и обширные родословные. Так, в Центре по Изучению

Полиморфизма Человека (CEPH) (Париж, Франция) была создана

уникальная коллекция перевиваемых клеточных культур от всех

членов семей, многоступенчатые родословные которых насчиты-

вают многие десятки и даже сотни индивидуумов (CEPH-семьи)

(Todd,1992; Weissenbach et al,1992). Перевиваемые линии кле-

ток получали из первичных культур, трансфорированных вирусом

Эпштейн-Барра, после чего такие лимфобластозные клетки ста-

новятся "бессмертными", то есть могут неограниченно долго

поддерживаться в условиях культивирования. CEPH-семьи

представляют собой идеальные системы для генетического ана-

лиза наследственных признаков. В результате исследования

этих клеточных линий определены генотипы членов CEPH-семей

одновременно по тысячам полиморфных локусов и построены

соответствующие генетические карты. Кроме того, совместными

усилиями многих лабораторий мира были созданы Банки Клеточ-

ных Культур, в которых поддерживаются коллекции лимфоб-

ластозных линий клеток, полученных от членов наиболее инфор-

мативных семей, в которых наблюдается сегрегация по различ-

ным наследственным признакам, в том числе по моногенным за-

болеваниям. Материал этих линий в виде клеточных клонов или

образцов ДНК используется, в частности, для анализа сцепле-

ния сегрегирующих генов с известными генетическими маркерами

или с вновь описанными полиморфными локусами. Таким образом,

во многих случаях при картировании генов человека удается

преодолеть ограничения, связанные с недостатком обширных ин-

формативных родословных.

Наконец, в начале 70-х годов появилась реальная возмож-

ность точной идентификации не только всех хромосом в карио-

типе человека, но и их отдельных сегментов. Это связанно с

появлением методов дифференциального окрашивания препаратов

метафазных хромосом, которые, по сути, произвели революцию в

цитогенетике и хромосомологии. Для получения дифференциаль-

ной окраски хромосомные препараты окрашивают некоторыми флю-

орохромами, либо, после соответствующей протеолитической об-

работки или нагревания, - красителем Гимза. При этом на хро-

мосомах выявляется характерная поперечная исчерченность, так

называемые бэнды, расположение которых специфично для каждой

хромосомы. На метафазных хромосомах малой степени спирализа-

ции идентифицируется около 750 таких полос, на прометафазных

хромосомах 2 500 - 3 000. Следовательно, величина небольших

бэндов на прометафазных хромосомах примерно соответствует 1

сМ на цитогенетических картах или 1 миллиону пар оснований

на физических картах. Такие ориентировочные рассчеты, как

уже упоминалось, оказываются полезными при сопоставлении

масштабов различных генетических карт.

Согласно официально утвержденной номенклатуре

(ISCN,1971) каждая хромосома человека после дифференциальной

окраски может быть разделена на сегменты, нумерация которых

начинается от центромерного района вверх (короткое плечо -

р), либо вниз (длинное плечо - q) (Рис.3.4). Полосы в каждом

сегменте также пронумерованы в аналогичном порядке. Крупные

полосы зачастую подразделяются на несколько частей, соот-

ветствующих более мелким бэндам, выявляемым только при ок-

раске малоспирализованных прометафазных хромосом. Запись по-

ложения гена на цитогенетической карте включает номер хро-

мосомы, плечо, а также номер сегмента, бэнда и его субъеди-

ницы. Например, запись 7q21.1 означает, что ген локализован

в субъединице 1, 1-го бэнда 2-го сегмента длинного плеча

хромосомы 7.

Такая подробная запись особенно удобна при использова-

нии для цитогенетического картирования метода гибридизации

in situ (см.Главу I), позволяющего локализовать ген с точ-

ностью до одного бэнда и даже его субъединицы. Основу данно-

го метода, как уже указывалось составляет гибридизация ге-

номной ДНК целых хромосом на разных стадиях их спирализации

с предварительно меченными специфическими ДНК-зондами.

Источником последних могут служить геномные последователь-

ности ДНК, сцепленные с картируемым геном, либо кДНК-овые

последовательности. В настоящее время из тканеспецифических

библиотек генов выделено около 20 000 анонимных последова-

тельностей кДНК, представляющих более 10 000 различных генов

человека (Sikela, Auffray, 1993). Эти кДНК составляют при-

мерно 10-15% всех кодирующих последовательностей генома. Ме-

тодом гибридизации in situ уже идентифицировано более 2000

генов, для многих из которых пока не найдено сцепление с по-

лиморфными маркерами (Poduslo et al., 1991). Такие кодирую-

щие последовательности присутствуют на карте генов человека,

но их пока нет на картах сцепления.

Раздел 3.3 Генетические индексные маркеры.

Как мы уже отмечали раньше, успешная локализация неиз-

вестного наследственного признака (гена) в значительной сте-

пени определяется присутствием на карте фланкирующих марке-

ров, находящихся на относительно небольшом расстоянии по обе

стороны от гена. В качестве генетических маркеров специфи-

ческих участков хромосом могут быть использованы любые лока-

лизованные в этих участках элементы генома с высоким уровнем

легко идентифицируемой популяционной изменчивости или поли-

морфизма. Отбор сцепленных с картируемым признаком генети-

ческих маркеров производят по результатам совместного анали-

за их сегрегации в информативных семьях.

Значительные успехи в геномном картировании были связа-

ны с использованием в качестве генетических маркеров широко

распространенной во многих популяциях изменчивости по изо-

ферментному спектру различных белков. Оказалось, что многие

ферменты у разных индивидуумов, в разных тканях и на разных

стадиях онтогенеза могут находиться в различных изоформах.

Такие варианты одного и того же белка обычно не отличаются

по специфической активности, но имеют измененную электрофо-

ретическую подвижность. Популяционный анализ изоферментов

обнаружил существование полиморфизма для очень многих белко-

вых систем, контролируемых разными генами, локализованными

во многих хромосомах. Таким образом, для этих хромосом были

найдены генетические маркеры, с помощью которых были иденти-

фицированы соответствующие группы сцепления.

Совершенствование молекулярных методов анализа специфи-

ческих последовательностей ДНК привело к обнаружению большо-

го числа высокоизменчивых участков генома - полиморфных сай-

тов рестрикции, гипервариабельных мини- и микросателлитных

последовательностей (см.Главу II) Эта изменчивость также бы-

ла использована для маркировки участков хромосом с целью

установления более точного взаиморасположения локусов. Вско-

ре после обнаружения полиморфных сайтов рестрикции были

опубликованы теоретические рассчеты, согласно которым от 10

до 20 таких локусов, расположенных равномерно на каждой хро-

мосоме на расстоянии около 20 сМ друг от друга, достаточно

для определения хромосомной принадлежности генов, от-

ветственных за любой тип наследственной изменчивости

(Botstein et al,1980). По этим оценкам около 200 таких ин-

дексных маркеров позволят построить карты сцепления для всех

известных генов на основании анализа сегрегации соответству-

ющих признаков в семьях с большим числом мутантов. Для опре-

деления порядка расположения генов на хромосомах и оценки

генетических расстояний между ними достаточно около 400 рав-

номерно распределенных полиморфных маркеров.

Идентификация в геноме человека большого числа поли-

морфных сайтов рестрикции и разработка простых методов ана-

лиза индивидуальной изменчивости по этим локусам существенно

повысили возможности локализации неизвестных признаков на

геномных картах. Уже к 1989г. были картированы более 2000

клонированных последовательностей ДНК, обнаруживающих поли-

морфизм по длине рестрикционных фрагментов (ПДРФ) в различ-

ных популяциях (Kidd et al., 1989). Более 1000 из них типи-

ровано в CEPH-коллекциях родословных. В значительной степени

это анонимные последовательности, связь которых со специфи-

ческими генами не установлена. Их наименования чаще всего

соответствуют названию отобранного из библиотеки генов кло-

на. В дальнейшем была разработана стандартная генетическая

номенклатура для обозначения используемых в качестве марке-

ров сегментов ДНК с неизвестной функцией. Первая буква D,

что значит ДНК, затем номер хромосомы, далее S для уникаль-

ных и Z для повторяющихся последовательностей и в конце но-

мер, идентифицирующий данный зонд в определенном районе ДНК.

Применение полиморфных сайтов рестрикции в качестве ге-

нетических маркеров имеет два ограничения: сравнительно низ-

кая информативность (частота гетерозигот не может превышает

50%- см. Главы II, Y) и неравномерное распределение

ПДРФ-сайтов по хромосомам. Этих недостатков практически ли-

шены гипервариабельные STR-сайты (ди-, три- и тетрануклеа-

тидные повторы). Использование микро- и минисателлитных ДНК

последовательностей в качестве индексных генетических марке-

ров открыло новую эру в построении карт сцепления генома че-

ловека. В настоящее время работа по идентификации высокопо-

лиморфных маркеров, перекрывающих весь геном и равномерно

распределенных по хромосомам практически завершенаа

(Weissenbach et al.,1992; Reed et al.,1994). Эта система

построена на базе динуклеотидных (C-A)n повторов.

(C-A)n*(G-T)n представляют собой наиболее частый класс

простых повторов, обнаруженных в геноме человека (за исклю-

чением An* Tn мультимеров). Такие повторы присутствуют при-

мерно в 1% колоний из геномных библиотек, сконструированных

на базе фрагментов длиной 300 - 500 п.о., которые образуются

после переваривания геномной ДНК эндонуклеазой Alu1. Более

90% из них оказываются полиморфными по числу копий в класте-

ре, причем в 70% локусов присутствует более трех аллелей. В

1992г. группе французских ученых под руководством Жана

Вайссенбаха удалось разработать систему идентификации с по-

мощью ПЦР индивидуальной изменчивости в местах локализации

(C-A)n повторов и на этой основе создать геномную карту из

814 высокополиморфных индексных маркеров со средним расстоя-

нием между ними около 5 сМ, получившую название

Genethon-коллекции микросателлитных маркеров (Weissenbach et

al., 1992). Для этого были просеквенированы более 12 000

фрагментов ДНК, выделенных из геномной Alu1-библиотеки путем

ее скрининга poly(dC-dA)*poly (dG-dT) ДНК-зондом. Праймеры

для амплификации подбирали из последовательностей ДНК, окру-

жающих повторы, используя для этого компьютерные программы.

Для дальнейшего анализа было отобрано около 3 000

(C-A)n-сайтов и проведена специфическая амплификация этих

участков у четырех неродственных CEPH-индивидуумов. На сле-

дующем этапе была определена хромосомная принадлежность по-

лутара тысяч наиболее информативных маркеров путем их иден-

тификации в панели из 18 соматических гибридных клонов, со-

держащих разные наборы хромосом человека. Детальная карта

сцепления индексных маркеров построена по результатам их ге-

нотипирования в коллекции 8 самых больших CEPH-родословных.

Предложенная система маркеров перекрывает все хромосомы, а

суммарное расстояние между ними соответствует примерно 90%

всего генома человека.

К 1994г. число индексных STR-маркеров было увеличено до

2 066, а средний интервал между соседними локусами уменьшен

до 2,9 сМ (Gyapay et al.,1994). В последнее время перспекти-

вы широкомасштабного картирования всего генома человека ста-

ли еще более значительны. Группой английских авторов под ру-

ководством Дж.Тодда была разработана система автоматического

скринирования 254 динуклеотидных маркеров, перекрывающих

весь геном человека со средним расстоянием между соседними

маркерами около 13 сМ. 80% этих повторов было отобрано из

Genethon-коллекции маркеров, остальные - из других источни-

ков (Genome Data Base, Baltimore). Амплификацию всех 254 по-

лиморфных сайтов проводили в 39 мультиплексных ПЦР (МПЦР),

причем используемые для этих целей олигопраймеры были мечены

четырьмя типами флюорохромов, так что аллели даже одинаково-

го молекулярного веса можно было различить на электрофорег-

рамме по цвету. В каждой из 39 МПЦР скринировали 7 - 9

STR-сайтов какой-то определенной хромосомы. Такие МПЦР-набо-

ры были разработаны для всех 22 аутосом и для Х-хромосомы.

Регистрация аллелей всех STR проводилась автоматическим

сканнером с использованием компьютерной программы Genotyper.

Только с помощью одного автоматического сканнера удается

проанализировать по этой схеме более 2.5 тысяч генотипов в

день! (Reed et al.,1994). Такая система уже сегодня открыва-

ет самые широкие возможности не только для генетического

картирования и создания подробных карт сцепления практически

любых моногенных заболеваний, но, что особенно существенно,

она делает реальной разработку стратегии картирования генов,

мутации которых предрасполагают к мультифакториальным забо-

леваниям, таким как диабет, гипертония, инфаркт миокарда,

психозы и многое другое.

Раздел 3.4 Хромосом-специфические библиотеки генов,

пульсирующий гель-электрофорез.

Используя столь обширную систему молекулярных маркеров

и проводя анализ сцепления на коллекциях клеточных культур

или на материале информативных родословных можно довольно

быстро привязать любой признак, особенно моногенный, не

только к определенной хромосоме, но даже к одному бэнду, оп-

ределить ближайшие фланкирующие маркеры и перейти не-

посредственно к позиционному клонированию с целью выделения

и идентификации самого гена. В этой связи важное значение в

картировании генов принадлежит молекулярно-цитогенетическим

подходам, являющимся принципиально важным звеном для успеш-

ного совмещения карт сцепления и физических карт целых хро-

мосом и их фрагментов.

Точность цитогенетического картирования определяется

степенью спирализации хромосом, характером использованной

метки и разрешающей способностью микроскопического оборудо-

вания. При картировании на стандартных метафазных хромосомах

и использовании радиоактивно меченых зондов точность карти-

рования ограничивается одним крупным бэндом или даже сегмен-

том хромосомы и составляет около 5-10 миллионов п.о. При

использовании биотиновой метки на прометафазных хромосомах

точность картирования возрастает в среднем в 5-10 раз (до 1

миллиона п.о.), а при работе со специально приготовленными и

растянутыми интерфазными хромосомами может доходить до 50

тысяч п.о.(Boehringer Mannheim Mannual,1992). Тем ни менее,

даже при такой разрешающей способности цитогенетическое кар-

тирование дает лишь весьма ориентировочные результаты и обы-

чно рассматривается как 1-й этап физического картирования.

Значительно более точные результаты достигаются на 2-м

этапе - этапе физического (рестрикционного) картирования.

Среднее расстояние между стандартными сайтами узнавания на

рестрикционных картах колеблется в пределах от 10 до 20 кб.

Из-за расхождений почти на два порядка масштабов цитогенети-

ческого и молекулярного картирования прямое сопоставление

этих типов физических карт практически невозможно.

Одним из способов преодоления этих трудностей является

конструирование хромосом-специфических библиотек генов. Как

уже упоминалось (см.Глава I,1.5) для приготовления таких

библиотек используют наборы клеточных линий соматических ги-

бридов с отдельными хромосомами человека либо хромосомы, ме-

ханически отобранные путем проточной цитометрии. Для некото-

рых видов молекулярного клонирования удобнее оказались биб-

лиотеки генов, построенные из субхромосомальных фрагментов.

Получение таких фрагментов достигается путем целенаправлен-

ного конструирования соматических гибридов, содержащих лишь

часть какой-либо хромосомы человека. Субхромосомные клоны

могут быть получены и с помощью микроманипуляций, при кото-

рых механически, под контролем микроманипулятора может быть

вырезан практически любой видимый фрагмент каждой хромосомы.

Разработаны также молекулярные методы выделения из генома и

идентификации крупных фрагментов ДНК, приближающихся по раз-

мерам к единичным хромосомным бэндам. Это стало возможным

после обнаружения редкощепящих рестриктаз, разрезающих ДНК

на фрагменты длиной от сотен тысяч до миллиона пар нуклеоти-

дов (Estivill, Williamson, 1987).

Другим важным шагом на пути клонирования и анализа

больших субхромосомальных фрагментов ДНК явилась разработка

методов их разделения путем гель-электрофореза в пульсирую-

щем поле (Barlow, Lehrach, 1987; Smith, Cantor, 1986; Smith

et al., 1987). В соответствии со стандартными методами

электрофореза под действием однонаправленного постоянного

поля в агарозном или в полиакриламидном гелях удается разде-

лять фрагменты ДНК размером не более 3 - 5 десятков килобаз.

Продвижение больших фрагментов ДНК в геле при пульсирующем

изменении направления электрического поля происходит, по

-видимому, за счет конформационных изменений, обусловленных

скручиванием и раскручиванием молекул ДНК в момент переклю-

чения направления поля. При этом более короткие молекулы

легче адаптируются к изменению условий и потому движутся в

геле быстрее. Существуют различные варианты пульсирующего

гель-электрофореза, главным образом, связанные с геометри-

ческим расположением направлений полей - ортогональный,

гексогональный, инверсионный. При использовании любого из

этих вариантов могут быть разделены молекулы ДНК размером от

50 кб до более, чем 9 миллионов п.о. Эффективность разделе-

ния фрагментов ДНК зависит не только от их размеров, но и от

условий проведения электрофореза (напряжение, температура

буфера, концентрация агарозы, время одного импульса). В ка-

честве маркеров для определения величины больших молекул ДНК

используют целые хромосомы дрожжей известной молекулярной

массы. В дальнейшем отбор крупных фрагментов ДНК, несущих

специфические последовательности, также может быть осущест-

влен путем блот-гибридизации с ДНК-зондами. Разделенные и

идентифицированные фрагменты ДНК могут быть элюированы из

геля и использованы для рестрикционного картирования, пост-

роения библиотек генов и для молекулярного клонирования с

целью идентификации и изоляции генных последовательностей. В

последнее время для изоляции крупных субхромосомальных сег-

ментов ДНК широко используется метод клонирования в

искусственных дрожжевых минихромосомах - YAC, и построения

библиотек генов на основе YAC-векторов.

Раздел 3.5 Позиционное клонирование, прогулка и прыжки

по хромосоме, идентификация и изоляция генов.

Мы уже упоминали, что средние размеры гена составляют

около 10-30 кб, варьируя в широких пределах (см.Глава II.2.

4). Единицы рекомбинации, размеры цитогенетических бэндов

и субхромосомных фрагментов ДНК измеряются миллионами пар

нуклеотидов, также как и размеры фрагментов ДНК, выделяемых

с помощью обработки геномной ДНК редкощепящими эндонуклеаза-

ми, пульсирующего электрофореза и клонирования в дрожжевых

минихромосомах. Переход от этих крупных фрагментов к после-

довательностям ДНК, сопоставимым с размерами гена, осущест-

вляют с помощью молекулярного клонирования, то есть получе-

ния набора фаговых или космидных клонов, содержащих относи-

тельно небольшие последовательности, насыщаяющие или пол-

ностью перекрывающие крупный сегмент ДНК, предположительно

содержащий идентифицируемый ген (Рис.3.5). Затем проводят

упорядочивание клонов в соответствии с взаимным расположени-

ем инсертированных в них фрагментов ДНК, осуществляя однов-

ременно молекулярный анализ этих фрагментов с целью иденти-

фикации регуляторных или кодирующих областей генов. Позднее

мы подробнее остановимся на тех критериях, с помощью которых

можно различить транскрибируемые и нетранскрибируемые участ-

ки генома. Для молекулярного клонирования используют различ-

ные подходы (Iannuzzi, Collins, 1990). Прежде всего, это

насыщающее клонирование, то есть изоляция из хромосом-специ-

фических библиотек нескольких сотен клонов с целью картиро-

вания различными методами инсертированных в них фрагментов

ДНК и идентификации клонов с последовательностями, локализо-

ванными в заданном районе. Значительно чаще используется

тактика скринирования фаговых, космидных и YAC библиотек,

сконструированных из субхромосомальных сегментов ДНК, пред-

варительно отобранных на основании сцепления с различными

ДНК-маркерами. При этом методы выделения субхромосомальных

сегментов ДНК могут быть самыми различными. Дальнейший поиск

в библиотеках генов клонов, содержащих транскрибируемые

последовательности ДНК, осуществляют достаточно трудоемкими

методами, получившими название "прогулки" и "прыжков" по

хромосоме.

"Прогулка" по хромосоме или скользящее зондирование

(Рис.3.6). заключается в последовательном отборе клонов, со-

держащих частично перекрывающиеся фрагменты ДНК из опреде-

ленного района генома (Rommens et al.,1989). На первом этапе

проводят скрининг библиотеки с помощью маркерной ДНК, сцеп-

ленной с геном. После нахождения положительных клонов

последние сами служат зондами для изоляции других клонов,

содержащих перекрывающиеся последовательности ДНК. Таким об-

разом, каждый раз отобранный фрагмент используется в качест-

ве скринирующего ДНК-зонда для последующего поиска. В ре-

зультате получют набор клонированных фрагментов ДНК, пол-

ностью перекрывающих область поиска гена. Группа подобных

клонов носит название "контигов". С помощью физического кар-

тирования инсертированной ДНК в разных клонах удается точно

установить степень перекрывания между соседними фрагментами

и соответственно упорядочить положение клонов в "контигах".

При скринировании космидных библиотек с выявлением каждого

нового клона к участку ДНК, полностью перекрытому отобранны-

ми зондами, в среднем добавляется около 20 кб. Таким спосо-

бом, однако, редко удается пройти более 200 - 300 кб в одном

направлении из-за наличия в геноме повторяющихся и трудно

клонируемых последовательностей ДНК.

Для преодоления этих ограничений и ускорения процесса

поиска генных последовательностей американским исследовате-

лем Фрэнком Коллинзом, ныне президентом Программы Геном Че-

ловека, был разработан метод "прыжков" по хромосоме. Этот

метод позволяет изолировать фрагменты ДНК, отстоящие в гено-

ме друг от друга на сотни тысяч нуклеотидов (длина прыжка),

не изолируя при этом все промежуточные последовательности

ДНК (Collins, Weissman, 1984). Как видно на представленной

схеме (Рис.3.7), прыжки начинаются со стартового зонда, то

есть с последовательности, гибридизующейся со сцепленным с

геном ДНК-маркером. Предварительно геномная ДНК переварива-

ется редкощепящей рестриктазой, в результате чего образуются

большие фрагменты ДНК, соответствующие по длине одному прыж-

ку. Затем, эти фрагменты переводятся в кольцевую форму за

счет искусственного присоединения к их концам небольшого

маркерного гена. При этом концы рестрикционных фрагментов

сближаются. Кольцевые молекулы ДНК разрезают среднещепящими

рестриктазами и из пула относительно небольших фрагментов

ДНК отбирают те, которые содержат маркерный ген, а, следова-

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14