: Литература - Другое (книга по генетике)

: Литература - Другое (книга по генетике)

личии рестрикции гибридизующийся фрагмент имеет меньшую дли-

ну. Таким образом, при анализе ДНК особей, в обеих хромосо-

мах которых присутствует сайт рестрикции в полиморфной об-

ласти, на электрофореграмме будет выявлен только один бэнд в

нижней области геля, соответствующий более короткому фраг-

менту ДНК. У особей, гомозиготных по мутации, изменяющей по-

лиморфный сайт рестрикции, будет наблюдаться один бэнд в

верхней части геля, соответствующий фрагменту большей длины,

тогда как у гетерозигот проявятся оба эти бэнда (Рис. 2.3а).

ПДРФ-анализ может быть значительно упрощен в том случае,

если возможна специфическая амплификация участка ДНК, содер-

жащего полиморфный сайт рестрикции. Тестирование состояния

этого локуса возможно путем проведения ПЦР и рестрикции амп-

лифицированного фрагмента. При отсутствии сайта узнавания в

исследуемой области ДНК размеры амплифицированного фрагмента

не изменятся после его обработки соответствующей эндонуклеа-

зой, тогда как при полном соответствии полиморфной области

сайту рестрикции образуются два фрагмента меньшей длины

(Рис.2.3б). У гетерозигот будут присутствовать 3 фрагмента,

один из которых по длине будет соответствовать размеру амп-

лификата до рестрикции, плюс 2 маленьких фрагмента с той же

суммарной длиной. Таким образом, как и в случае использова-

ния для анализа блот гибридизации по Саузерну, трем возмож-

ным вариантам генотипа будут соответствовать три различных

варианта электрофореграмм.

Необходимо подчеркнуть, что первичная идентификация по-

лиморфных сайтов рестрикции, сцепленных с определенными ге-

нами, возможна только при наличии соответствующих ДНК-зон-

дов. Дальнейшая тактика заключается в поиске рестрикционной

нуклеазы, выявляющей полиморфизм. С этой целью используют

широкий набор эндонуклеаз для рестрикции геномной ДНК, выде-

ленной из группы неродственных индивидуумов, представляющих

собой репрезентативную выборку популяции. Затем проводят

ПДРФ-анализ отдельно для каждой из рестриктаз с набором име-

ющихся ДНК-зондов. После обнаружения полиморфизма в одной из

популяций аналогичные исследования проводят в других популя-

циях.

Следует учитывать, что полиморфные сайты рестрикции

всегда представляют собой двухаллельную систему, поэтому да-

же при самой высокой вариабильности такого сайта, число ге-

терозиготных по данному локусу особей в популяции не будет

превышать 50% Между тем, только при наличии полиморфного

сайта в гетерозиготном состоянии можно отличить мутантный

аллель от нормального, то есть осуществить его молекулярную

маркировку. Следовательно, информационная емкость такого по-

лиморфизма относительно невелика ( см. Главы Y и VII).

Раздел 2.6 Вариабильные микро- и минисателлитные ДНК.

Гипервариабильные сателлитные повторы являются гораздо

более информтивными маркерами по сравнению с полиморфными

сайтами рестрикции, так как представляют собой мультиаллель-

ные системы с уровнем гетерозиготности, достигающим 70 -

90%. Кроме того, оказалось, что количество высокоизменчивых

микрои минисателлитных последовательностей в геноме челове-

ка, по-видимому, превышает несколько десятков тысяч, они

достаточно плотно и равномерно расположены в каждой из хро-

мосом. Так более 90% из 5000 идентифицированных (C-A)-повто-

ров являются полиморфными, причем в большинстве из них уро-

вень гетерозиготности значительно превышает 50% (Weissenbach

et al, 1992). Среди гипервариабильных мини-сателлитных

последовательностей различают варьирующие по числу тандемные

повторы - VNTR, три-, тетра- и пентануклеотидные повторы, а

также некоторые другие классы повторов. Общее число высоко-

полиморфных минисателлитных последовательностей в геноме

превышает 1500 (Armour et al., 1990; Charlesworth et al.,

1994). VNTR (variable number tandem repeats - варьирующие по

числу тандемные повторы) -характеризуются наличием 10 - 15 -

ти нуклеотидных "коровых" последовательностей, сходных с

контролирующими элементами рекомбинации E.coli (Jeffreys et

al., 1985). С помощью ДНК-зондов, сконструированных на осно-

ве тандемно повторяющихся "коровых" последовательностей,

можно анализировать индивидуальную изменчивость в единичных

или множественных высокополиморфных локусах, несущих одно-

типную коровую последовательность. Примером может служить

VNTR, обнаруженная в интроне миоглобинового гена, включающая

четыре тандемных повтора из 33 п.о., фланкированных прямыми

повторами из 9 п.о. Полученные из этого района ДНК-зонды с

успехом используются для идентификации личности методом

ДНК-фингерпринта, так как вероятность совпадения аллелей у

двух неродственных индивидуумов по всем гипервариабильным

локусам, гибридизующихися с этим ДНК-зондом, значительно

меньше 10!-7 (Jeffreys et al.,1991). Высокополиморфные VNTR

найдены также в гене инсулина, в области глобинового псевдо-

гена и в Х-хромосоме, содержащей последовательности, гомоло-

гичные ДНК вируса гепатита В (Nakamura et al., 1985). В

последнее время многочисленные VNTR- последовательности об-

наружены в хромосомах 1, 2q, 14, 16, 17, 19 (O'Brien,1992).

Поиск новых гипервариабильных локусов основан на системати-

ческом скрининге клонированных последовательностей ДНК с по-

мощью искусственно синтезированных "коровых" зондов. Особен-

но удобны для такого скрининга геномные библиотеки,

сконструированные на основе предварительно фракционированных

по величине Mbo1 или Sau3A1 фрагментов ДНК, так как большие

фрагменты обогащены длинными и более вариабильными минисате-

литными последовательностями (Armour, et al., 1990). Хорошие

результаты были получены также при скринировании космидных

библиотек с помощью G-богатых синтетических ДНК-зондов и

использование хемолюминесцентного метода в сочетании с ПЦР

(Decorte, Cassiman, 1990). В некоторых случаях с этой целью

применяют также последовательности ДНК, выделенные из фага

М13, имеющего в своем составе сходные структуры (Armour

etal., 1990).

Одним из вариантов минисателлитных последовательностей

являются тримерные и тетрамерные короткие тандемные повторы

-STR (short tandem repeats), которые стабильно наследуются и

также обладают высоким уровнем полиморфизма по числу коровых

единиц (Edwards et al., 1991). В X хромосоме такие повторы

обнаружены через каждые 300 - 500 кб, тогда как в других

частях генома они встречаются на расстоянии 10 кб друг от

друга. По некоторым оценкам их частота может достигать 1/20

кб (Charlesworth et al.,1994). Возможно, истиное число три-

и тетрамерных повторов в геноме человека еще больше, так как

они обнаружены во многих генах. Подобно другим повторам STR

обычно встречаются в некодирующих частях генов. В последнее

время, однако, обнаружена группа структурных генов, несущих

тримерные повторы в регуляторных и даже в транслируемых

частях генов. Изменения числа этих внутригенных повторов в

сторону их увеличения может приводить к нарушению функции

этих генов вплоть до полного блока экспрессии и быть причи-

ной ряда тяжелых наследственных заболеваний - болезни

экспансии (см.Главу X). В качестве зондов для выявления ко-

ротких тандемных повторов используют синтетические олигонук-

леотиды, построенные из простых повторов трех или четырех

нуклеотидов.

В последнее время для обнаружения различных классов

микросателлитных последовательностей и STR-повторов применя-

ют эффективные методы, основанные на использовании ПЦР

(Edwards et al., 1991). Для этих локусов характерно большое

число аллелей, которые различаются по числу коровых единиц.

Продукты амплификации этих сайтов могут отличаться друг от

друга числом ди- три- или тетрануклеотидных повторов. Для

удобства идентификации различных аллелей полимеразную цепную

реакцию проводят в присутствии меченых нуклеотидов, а для

электрофоретического разделения продуктов амплификации

используют специальные секвенирующие гели. Многие STR-локусы

настолько полиморфны, что нашли применение в судебной меди-

цине для идентификации личности. Для повышения достоверности

результатов с этой целью используют мультиплексные варианты

ПЦР, позволяющие устанавливать генотип индивидуума одновре-

менно по нескольким STR-сайтам (Weber,May, 1994; Асеев и

др.,1995). Возможность точного генотипирования личности с

использованием полимеразной цепной реакции, то есть на мини-

мальном количестве ДНК, является важным методическим преиму-

ществом STR перед ранее рассмотренными VNTR, для анализа ко-

торых чаще используют блот-гибридизацию по Саузерну.

Высокая частота коротких тандемных повторов, уникаль-

ность комбинаций числа тетра-, три- и димеров в разных сай-

тах в сочетании с их большой вариабильностью и сравнительной

легкостью идентификации аллелей позволяет широко использо-

вать эти повторы для генетического и физического картирова-

ния в качестве наиболее удобных индексных маркеров геномных

ДНК-последовательностей (см.Главу III). Такие маркерные сай-

ты получили название STS (sequence tagged sites). В настоя-

щее время в геноме человека уже идентифицировано около 10

000 STS, подавляющее большинство которых представляет собой

тандемные повторы 2 - 4 нуклеотидов. Благодаря выраженной

индивидуальной специфичности и достаточно стабильному менде-

левскому типу наследования STS-сайты нашли широкое примене-

ние и в молекулярной диагностике генных болезней, прежде

всего в качестве молекулярных маркеров для идентификации му-

тантных хромосом в семьях высокого риска (см. Главу VII).

Наличие большого числа гипервариабильных микро- и минисател-

литных последовательностей ДНК является характерной особен-

ностью генома человека. Аналогичные последовательности, об-

наруженные в геноме приматов, значительно более однородны,

что доказывает возможность существенного увеличения вариа-

бильности этих участков ДНК за сравнительно короткий эволю-

ционный промежуток (Юров,1988; Gray et al., 1991).

Сведения о мутабильности высокополиморфных последова-

тельностей в геноме человека весьма противоречивы. Показано,

однако, что в наиболее вариабильных минисателлитных локусах

частота мутаций может достигать 5% на гамету (Jeffreys et

al., 1988). Предполагается, что одной из главных функций ги-

первариабильных микро- и минисателлитных последовательностей

ДНК может быть контроль гомологичной рекомбинации в мейозе.

На культурах клеток показано стимулирующее влияние миниса-

теллитных последовательностей ДНК на гомологичную рекомбина-

цию. Так, инсерция синтезированной последовательности,

составленной на основе гипервариабильных минисателлитов в

геномную ДНК приводит к более, чем 10-кратному увеличению

числа реципрокных обменов, причем степень этого влияния об-

ратно пропорциональна расстоянию между STR и сайтом рекомби-

нации (Wahls et al., 1990). Вместе с тем, многие авторы об-

ращают внимание на достаточно высокую стабильность миниса-

теллитных аллелей, что позволяет их широко использовать как

для генетического маркирования, так и для популяционных

исследований и идентификации личности методом ДНК-фингерп-

ринта (Decorte,Cassiman 1993; Edwards et al.,1991; Ива-

нов,1989).

Для многих мутаций, локализованных в некодирующих

частях генома, характерны высокие уровни популяционного по-

лиморфизма. Необходимо, однако, подчеркнуть, что эта измен-

чивость не затрагивает общей структуры генома, определяющей

различия между видами. Более того, сопосталение первичных

нуклеотидных последовательностей сравнительно протяженных

секвенированных участков ДНК (области Т-рецепторных генов

длиной около 100 кб) обнаружило сохранение высокой степени

гомологии не только в кодирующих, но и, что особенно удиви-

тельно, в некодирующих частях этих последовательностей. Если

учесть, что эволюционно человек и мышь разделены почти 80

миллионами лет эволюции, эти данные рассматриваются как сви-

детельство функциональной значимости некодирующих частей

этих генов По-видимому, далеко не всякие мутации в некодиру-

ющих районах ДНК являются нейтральными и в определенных слу-

чаях они могут отрицательно влиять на жизнеспособность. К

сожалению, в настоящее время ничего или почти ничего неиз-

вестно о функциях некодирующих ДНК-последовательностей.

Высказывалось даже предположение, что их единственной функ-

цией является репликация. Отсюда возникло представление об

"эгоистической" или "паразитической" ДНК. Конечно, полностью

исключить наличие подобных паразитических последователь-

ностей ДНК в любом геноме нельзя. Тем ни менее, представля-

ется маловероятным, что значительная часть генома человека,

также как и других видов, относится к эгоистической ДНК.

По-видимому, наши знания о роли некодирующей или, как еще

говорят, "избыточной" ДНК все еще явно недостаточны. Ста-

бильность структурной организации генома в пределах вида

свидетельствует скорее о важной эволюционной роли некодирую-

щих ДНК-последовательностей и об их участии в процессах он-

тогенеза. Можно предполагать, что ответ на этот интригующий

вопрос в какой-то мере будет получен при расшифровке и срав-

нении полной первичной нуклеотидной последовательности гено-

мов у животных разных видов и, прежде всего, у человека и

мыши, где прогресс в секвенировании геномной ДНК особенно

значителен (см.Главу III). Уместно заметить, что проведенный

недавно компьютерный анализ генома человека позволяет пред-

полагать наличие в его некодирующей части особого, пока еще

непонятного генетического кода, смысл и значение которого

остаются загадочными ( ?).

Раздел 2.7 Мобильность генома, облигатные и факульта-

тивные элементы генома.

До сих пор мы рассматривали основные структурные эле-

менты генома человека, положение которых в соответствии с

представлениями классической генетики достаточно постоянно.

Начиная с 50-х годов стали накапливаться данные о существо-

вании большого числа мобильных генетических элементов,

присутствие которых в геноме не является обязательным, а их

топография и количество может варьировать в различных клет-

ках, тканях и у разных индивидуумов (McClintock, 1984; Berg,

Howe, 1989). У прокариот такие элементы получили название

транспозонов. Их структура и функции достаточно хорошо изу-

чены. Отличительной особенностью мобильных элементов явля-

ется способность существовать как в интегрированном с хро-

мосомой виде, так и в виде отдельных макромолекул - эписом,

плазмид, вирусных частиц. Почти 50 различных семейств мо-

бильных элементов описано у дрозофилы . Вместе эти последо-

вательности составляют около 12% гаплоидного набора

(Golubovsky, 1995). В геноме млекопитающих содержится до 50

000 диспергированных копий ретропозона LINE размером около

6500 пар основанийю. Семейство Alu- повторов, содержащее от

300 до 500 тысяч копий, также относится к числу мобильных

элементов генома (Сharlesworth et al.,1994). Явление лизоге-

нии, то есть присутствие вирусных последовательностей в

составе ДНК человека и наличие фрагментов генов человека в

вирусных геномах, служит одним из примеров мобильности ДНК и

возможности "горизонтальной" передачи наследственно закреп-

ленных признаков между видами. Мобильные ДНК, как правило,

относятся к факультативным элементам. Как уже отмечалось, не

существует четких границ между облигатными и факультативными

элементами генома, так как возможен взаимный переход от од-

ного состояния к другому. Структурные локусы или сегменты

хромосом могут трансформироваться в факультативные элементы

за счет амплификации, интеграции в мобильные элементы или

путем образования цитоплазматических ретротранскриптов. Об-

ратный переход от факультативных элементов к облигатным осу-

ществляется посредством инсерций, транспозон-индуцированных

перестроек и обратной транскрипции.

Факультативные элементы существуют в геноме как популя-

ции информативных макромолекул. Изменения, возникающие в них

под воздействием внешних факторов, носят совершенно иной ха-

рактер по сравнению с классическими мутациями в структурных

локусах. Для описания изменений в факультативных элементах

предложен термин " вариации" (Голубовский, 1985). Этот тер-

мин впервые использован Жакобом и Воллманом для описания по-

ведения эписом (Jacob, Wollman, 1961). Вариации могут приво-

дить к изменениям на генотипическом уровне, то есть к мута-

циям, вследствие простого перемещения факультативных элемен-

тов или сдвига в соотношении между факультативными и обли-

гатными элементами. В этих случаях мутации встречаются од-

новременно у многих индивидуумов. Подобные изменения упоря-

дочены, могут происходить сразу во многих локусах и отлича-

ются высокой сайт-специфичностью. Локализация структурных

перестроек, возникающих в результате вариаций, предопределе-

на первоначальной топографией факультативных элементов на

хромосомах. И наконец, сами вариации могут быть индуцированы

обычными "не-мутагенными" факторами, такими как температура

или межлинейные кроссы (Golubovsky, 1995). Факультативные

элементы могут рассматриваться как оперативная память гено-

ма, так как во многих случаях спонтанное возникновение мута-

ций в облигатных элементах опосредовано их активацией. Счи-

тается, в частности, что инсерционный мутагенез является

причиной спонтанного возникновения 70% видимых мутаций в

природных популяциях дрозофилы. Однако, у человека пока за-

регистрированы лишь единичные случаи возникновения мутаций

вследствие перемещения мобильных элементов генома (Vidaud et

al.,1993).

Раздел 2.8 Изохоры, метилирование, гиперчувствительные

сайты.

Перечисленные выше компоненты генома не случайным обра-

зом связаны с последовательностями нуклеотидов. И в этом

смысле можно говорить о существовании в геноме человека

структур более высокого иерархического порядка. Примером

служат изохоры - длинные, в среднем, свыше 300 кб сегменты

ДНК, гомогенные по композиции оснований или по GC-уровням.

62% генома состоит из GC-бедных изохор и в них локализовано

около 34% генов, 31% генома представлен GC-богатыми изохора-

ми, содержащими 38% генов, и в 3% изохор, обогащенных

GC-последовательностями (так называемых H3 изохор), нахо-

дится 28% генов (Mouchiroud et al., 1991; Saссone et al.,

1993). Таким образом, существуют относительно небольшие

участки ДНК, в которых плотность генов в 10 -20 раз выше,

чем в остальных последовательностях.

Другой общей чертой генома человека является то, что in

vivo значительная доля цитозиновых остатков в молекуле ДНК

метилирована, то-есть находится в форме 5-метилдезоксицити-

дина. Экспериментальное изучение характера метилирования

основано на сопоставлении рестрикционных фрагметов, образую-

щихся после обработки ДНК эндонуклеазами, для которых сайты

узнавания одинаковы и содержат в своем составе цитозин, но

действуют эти ферменты по-разному, в зависимости от того,

находится ли это основание в метилированном состоянии или

нет. В частности, рестриктазы - Msp1 и Hpa11, узнают после-

довательность CCGG, но в отличие от Msp1, Hpa11 не расщепля-

ет ДНК в тех сайтах, где внутренний CpG динуклеотид метили-

рован. Некоторые сегменты генома, особенно это относится к

повторяющимся последовательностям, полностью метилированы в

местах 5'-CCGG-3' и частично метилированы в 5'-GCGC-3' -

сайтах рестрикции для Hha1. В других сегментах наблюдается

характерный рисунок частичного метилирования в 5'-CCGG-3'

последовательностях (Behn-Krappa et al., 1991). Различные

индивидуумы, независимо от их этнического происхождения,

практически не различаются по характеру метилирования ДНК в

одних и тех же типах тканей, тогда как в процессе онтогене-

тической дифференцировки происходят значительные изменения

рисунков метилирования. В перевиваемых культурах клеток опу-

холевого происхождения число метилированных сайтов резко

уменьшено.

Высказано предположение о наличии прямой связи между

метилированием ДНК и состоянием генетической активности в

клетках. Существует класс белков, которые специфическим об-

разом связываются с метилированными участками ДНК, делая их

недоступными для действия ряда ферментов, в том числе, воз-

можно, и для полимераз. Получено много прямых эксперимен-

тальных доказательств роли метилирования ДНК в инактивации

эукариотических промоторов, а, значит, и в регуляции актив-

ности генов. Напротив, гипометилирование промоторной области

генов, в особенности CpG островков, как правило, свиде-

тельствует о функциональной активности генов. Показано, что

необычные структуры в молекуле ДНК, также как экзогенная

ДНК, инкорпорированная в процессе генетической трансформа-

ции, нередко подвергаются метилированию. Известно, что мети-

лирование играет важную роль в инактивации X хромосомы у са-

мок, в регуляции экспрессии генов в процессе развития, а

также непосредственно вовлечено в феномен хромосомного (ге-

номного) импринтинга, связанного с различиями пенетрантности

некоторых аллелей в зависимости от их происхождения, то есть

прохождения через материнский или отцовский гаметогенез (Ба-

ранов, 1991).

В GC-богатых изохорах локализовано большое количество

CpG островков - последовательностей от 500 до 2000 п.о., ха-

рактеризующихся очень высоким содержанием гуанина и цитозина

(G+C > 60%), представленных в виде кластеров неметилирован-

ных CpG дуплетов и, так называемых, G/C боксов - локусов,

родственных сайту узнавания для одного из транскрипционных

факторов Sp1 - (G)4C(G)4C (Lindsay, Bird, 1987; Bird, 1986;

Aissani, Bernardi, 1991). CpG острова содержат много сайтов

узнавания для чувствительной к метилированию эндонуклеазы

HpaII, а также сайты для редкощепящих рестриктаз, узнающих

неметилированные CpG дуплеты. В частности, более 80%

Nor1-сайтов связано с CpG-богатыми островками. Как правило,

CpG островки локализованы в 5'- фланкирующих последователь-

ностях, 5'-зкзонах и 5'-интронах всех изученных хаузки-

пинг-генов и 40% тканеспецифических генов. CpG островки яв-

ляются характерной особенностью транскрибируемых участков

генома. Их идентификация в клонированных последовательностях

геномных библиотек существенно облегчает поиск конкретных

структурных генов (см.раздел 2.4) . Наибольшая плотность CpG

островков наблюдается в теломерных участках хромосом 1, 9,

15, 16, 17, 19, 20, 22 (Antonarakis,1994). Точные молекуляр-

ные методы регистрации СрG островков показали, что их число

в геноме человека приближается к 45000 (

Antequera,Bird,1993).

Можно также отметить существование в геноме человека

сайтов, гиперчувствительных к действию ДНК-азы 1 и структур-

но отличающихся от основной массы хроматина. Присутствие та-

ких сайтов показано для многих генов млекопитающих и, по-ви-

димому, это необходимое, но не достаточное условие их

экспрессии. Локализация гиперчувствительных сайтов может ме-

няться в процессе развития и под действием гормонов. В неко-

торых случаях эти участки маркируют положение транскрипцион-

ных регуляторных элементов генома, действующих как в положи-

тельном, так и в отрицательном направлениях. В других случа-

ях это области функционально активных генов, находящихся в

деспирализованном состоянии и имеющих однонитевую структуру.

Именно такие однонитевые участки ДНК особенно выско чувстви-

тельны к ДНК-азе 1. На этом их свойстве основан метод

ник-трансляции in situ, позволяющий непосредственно на хро-

мосомных препаратах визуализировать функционально активные

районы хромосом. С этой целью хромосомные препараты обраба-

тывают ДНК-азой 1, после чего непосредственно на них с по-

мощью ДНК-полимеразы проводят синтез ДНК в присутствии мече-

ных нуклеотидов. При этом метка включается преимущественно

только в те участки хромосом,где находятся функционально ак-

тивные гены (Verma, Babu, 1989).

ГЛАВА YIII.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МОДЕЛИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЧЕЛОВЕКА.

Раздел 8.1. Генетические линии животных.

Большая роль в исследовании проблем генетики челове-

ка и медицинской генетики принадлежит мутантным генетическим

линиям животных и, в особенности, генетическим линиям мышей

(Конюхов, 1969, 1980; Корочкин, 1978). Высокий процент

сходства по нуклеотидными последовательностям между кодирую-

щими, регуляторными и даже интронными областями гомологичных

генов млекопитающих и человека, а также наличие большого

числа консервативных групп сцепления с идентичным расположе-

нием генов наряду с возможностями использования очень мощных

экспериментальных подходов для идентификации и клонирования

генов линейных животных позволяют проводить параллельные

исследования, значительно ускоряющие эффективность поиска и

молекулярного анализа индивидуальных генов человека.

Для многих моногенных заболеваний человека животные,

несущие мутации в гомологичных генах, являются лучшими, а

зачастую и единственными моделями для исследования молеку-

лярных основ патогенеза и отработки оптимальных схем лече-

ния, в том числе и с применением методов генной терапии

(см.Главу IX). Поиск таких биологических моделей, прежде

всего, ведется, среди уже существующих генетических линий

животных с установленным типом наследования определенных

аномальных признаков. Наиболее трудным при этом является до-

казательство идентичности мутантных генов и, соответственно

первичных биохимических дефектов, у человека и у линейных

животных.

В различных питомниках мира, в том числе и в России,

созданы и поддерживаются кллекции, насчитывающие от десятков

до несколько сотен генетических линий различных эксперимен-

тальных животных - мышей, крыс, кроликов, собак и др. (Коню-

хов, 1969; 1980; Staat, 1969; Hogan et al, 1989; Бландова и

др., 1990). Среди них генетические линии мышей наиболее мно-

гочислены в первую очередь из-за высокой плодовитости,

удобства содержания, относительной легкости эксперименталь-

ного манипулирования и целого ряда других причин. Некоторые

из этих линий представляют собой случайные находки, другие,

а их большинство, получены в результате действия различных

мутагенных факторов. Так, значительное число биологических

моделей было получено путем биохимической селекции потомства

мышей самцов, обработанных сильными мутагенами - этилнитроз-

мочевиной, триэтиленмеламином или облученных Рентгеном. Так

были смоделированы на мышах альфа-талассемия, полицитемия,

почечный ацидоз (Erickson, 1988). Однако, такой способ полу-

чения животных-моделей, хотя и более эффективен, чем поиск

спонтанно мутировавших особей, также основан на чистой слу-

чайности и не позволяет направленно менять структуру нужного

гена.

Процесс создания подобных генетических линий обычно

включает отбор особей с фенотипическими отклонениями; анализ

наследования этих фенотипческих признаков; длительное близ-

кородственное разведение отселектированных особей. При моно-

генном наследовании такие линии могут либо целиком состоять

из мутантных гомозигот, либо поддерживаться через гетерози-

готных особей в случае сниженной жизнеспособности и наруше-

ния плодовитости у гомозигот.

На первом этапе поиска адекватной модели какого-либо

моногенного наследственного заболевания руководствуются

сходством клинических проявлений течения болезни и фенотипом

мутантных животных. Однако, одного этого сходства недоста-

точно (Конюхов, 1969). Необходимо доказать гомологичность

генотипической природы наблюдаемых нарушений, то есть дока-

зать, что у человека и у животных (мышей) фенотипические из-

менения обусловлены мутациями в гомологичных генах. Огромная

мировая генетическая коллекция мышей насчитывет несколько

сотен линий, в каждой из которых различные дефекты наследу-

ются по моногенному типу. Спонтанные биологические модели

наследственных болезней известны и достаточно полно изучены

для многих других экспериментальных и домашних животных.

Представляется удивительным, что, несмотря на большое

сходство геномов млекопитающих и наличие близких по первич-

ной структуре и тождественных по функциям структурных генов,

для значительной части наследственных болезней человека ге-

нетические аналоги среди животных до сих пор не найдены (Ко-

нюхов, 1969).

Это ограничение в настоящее время может быть преодалено

путем целенаправленного конструирования генетических модель-

ных линий животных. Экспериментальные основы такого подхода

уже хорошо разработаны (Erickson, 1988; Аллен и др., 1990;

Melton, 1993; Stewart et al., 1994). Для этого используют

технику культивирования и трансфекции эмбриональных стволо-

вых клеток (см.ниже), отбор in vitro клонов с нужными генет-

ческим изменениями и пересадку их в зародыши или в сомати-

ческие ткани животных. Для анализа экспрессии мутантных ге-

нов in vivo и оценки их биологического действия особенно

удобными оказались трансгенные животные.

Раздел 8.2. Трансгенные животные.

Трансгенных животных получают в результате искусствен-

ного введения - трансгеноза, чужеродного генетического мате-

риала, представляющего из себя фрагмент гена или иную после-

довательности ДНК, в оплодотворенную яйцеклетку или в ранние

зародыши млекопитающих. Подобные модели являются идеальными

экспериментальными системами для исследования молекуляр-

но-генетических основ онтогенеза, для изучения функции чуже-

родного гена, оценки его биологического действия на орга-

низм, а также для производства различных манипуляций со спе-

цифическими клеточными клонами in vivo. Разработано несколь-

ко способов получения трансгенных животных. Исторически бо-

лее ранним и широко применяемым до настоящего времени явля-

ется микроиньекция чужеродной ДНК в пронуклеус - ядро опло-

дотворенной яйцеклетки. Существуют детальные описания этого

метода (Аллен и др., 1990; Hogan et al, 1989). Суть метода

состоит в том, что под контролем микроскопа при помощи мик-

романипулятора в мужской пронуклеус оплодотворенной яйцек-

летки тонкой иглой (до 1 микрона) вводят около 2 пиколитров

раствора ДНК. Чужеродная ДНК, вначале свободно лежащая в

нуклеоплазме, в течение нескольких последующих делений дроб-

ления случайным образом интегрирует в один из сайтов ка-

кой-либо хромосомы, то есть встраивается в ДНК-реципиента.

При этом, как показали эксперименты с меченой ДНК, в различ-

ных бластомерах одного и того же дробящегося зародыша интег-

рация может происходить в разные хромсомные сайты и число

интегрированных копий ДНК в каждом из этих сайтов может зна-

чительно варьировать. Тем не менее, поскольку сам эмбрион

развивается, по-сути, из одного бластомера, во всех клетках

такой особи после рождения чужеродная ДНК обычно находится

только в одном каком-нибудь хромосомном сайте, хотя у разных

особей она интегрируется по-разному и в разные сайты. После

введения чужеродной ДНК в пронуклеус яйцеклетку транспланти-

руют самке-реципиенту. Доля трансгенных животных в потомстве

таких самок варьирует от 10% до 30%. Это означает, что по-

добный механический вариант трансфекции чужеродных генов на

ранней стадии эмбриогенеза является чрезвычайно эффективным.

Идентификацию трансгенных животных производят путем анализа

геномной ДНК на наличие экзогенных последовательностей, ис-

пользуя при этом методы блот-гибридизации или ПЦР. Экспрес-

сию введенного гена анализируют путем идентификации специфи-

ческих мРНК и/или соответствующих белковых продуктов в раз-

личных тканях трансгенного животного.

Другой, более более прогрессивный способ получения

трансгенных животных основан на том, что трансфекции подвер-

гается не зигота, а тотипотентные эмбриональные стволовые

клетки (см.ниже), которые затем трансплантируют в полость

бластоцисты (Gardner, 1978). Этот метод и его решающие преи-

мущества в плане генетического моделирования подробно

рассмотрены в разделе 8.4.

Как правило, иньецированная ДНК при встраивании в хро-

мосому образует блок из множества тандемно расположенных ко-

пий, при этом число единиц повтора в блоке у разных

особей может варьировать от единицы до нескольких сотен.

После интеграции введенной ДНК в хромосому различные генети-

ческие конструкции устойчивы и стабильно передаются по-

томству в соответствии с законами Менделя. Встраивание вве-

денной ДНК в функционально значимые области генома может

приводить к их дестабилизации и сопровождаться появлением

мутаций, спектр которых очень разнообразен. Таким образом,

животные, полученные при введении одного и того же гена, бу-

дут различаться как по сайтам интеграции, так и по количест-

ву копий встроенной чужеродной ДНК, а в некоторых случаях,

по уровню мутабильности и по типам индуцированных мутаций.

Таким образом, каждое трансгенное животное в этом смысле

уникально.

Трансгенные животные являются черезвычайно удобным обь-

ектом для анализа роли отдельных элементов гена в регуляции

его работы. Так, сопоставление характера экспрессии введен-

ного гена у животных, различающихся по длине фланнкирующих

последовательностей иньецированной ДНК, дает возможность об-

наружить элементы гена, контролирующие его работу в разных

типах тканей. Для облегчения анализа регуляторных последова-

тельностей гена часто вводят генетические конструкции, соче-

тающие эти элементы с геном-репортером, экспрессия которого

выражается в появлении известной и легко определяемой фер-

ментативной активности. Использование для трансгеноза реком-

бинантных молекул ДНК, представляющих собой различные комби-

нации регуляторных элементов и кодирующих последовательнос-

тей, ведет к более глубокому пониманию молекулярных механиз-

мов активации генов в разных типах тканей.

Как уже указывалось, случайный характер интеграции чуже-

родной ДНК нередко индуцирует мутации и нарушает экспрессию

нормальных генов реципиента. В ряде случаев наблюдаемые отк-

лонения в развитии оказываются аналогичными или сходными с

уже известными наследственными нарушениями у человека и по-

добные животные также могут использоваться в качестве гене-

тических моделей заболеваний. Этот подход был применен для

получения моделей таких заболеваний, в патогенезе которых

решающую роль играет эффект дозы генов. В частности, путем

трансфекции зиготы мышей генами бета-глобина, коллагена, ре-

нина, антигенов гистосовместимости удалось получить биологи-

ческие модели таких заболеваний, как бета-талассемия, несо-

вершенный остеогенез, гипертония и диабет, соответственно

(Erickson, 1988). Во всех перечисленных случаях введение до-

полнительной дозы экспрессирующего гена приводило к наруше-

нию балланса белковых генопродуктов в клетках и, как следс-

твие этого, было причиной патологических процессов.

Раздел 8.3. Экспериментальное моделирование.

Другой вариант биологического моделирования основан на

получении животных с определенными очень специфичными, но

ненаследственными изменениями. Эти животные также могут быть

использованы для анализа молекулярных основ патогенеза и

разработки методов адекватного лечения. Рассмотрим несколько

примеров подобного экспериментального моделирования.

Описанная технология трансгеноза (введение генов в про-

нуклеус) может быть использована, в частности, для направ-

ленного получения животных с избирательными дефектами

(уродствами) тех или иных тканей и органов. Метод заключает-

ся в возможности селективной элиминации тех специфических

типов клеток, которые отсутствуют или дефектны у больных с

моделируемым типом заболевания. Такие животные могут быть

получены при иньекции в зародыш рекомбинантной ДНК, содержа-

щей какой-либо цитотоксический ген, например, ген дифтерий-

ного токсина, находящийся под контролем работающих в опреде-

ленных типах клеток регуляторных элементов ДНК. При актива-

ции этих контролирующих элементов на определеной стадии раз-

вития экспрессия токсического гена приводит к избирательной

гибели всей специфической популяции клеток, то есть такая

система действует как очень точный скальпель.

Дальнейшая модификация метода заключается в использова-

нии для трансгеноза условно летального гена, каким является,

например, ген тимидинкиназы вируса Герпеса. Клетки,

экспрессирующие этот ген, функционируют совершенно нормаль-

но. Однако, на любой стадии онтогенетического развития можно

вызвать их селективную гибель при введении животному ганцик-

ловира - противогерпесного препарата. Эта система дает боль-

ше возможностей для экспериментального анализа роли специфи-

ческих клонов клеток в процессе нормального развития, а так-

же для изучения патологичеких процессов, связанных с гибелью

этих клеток. Подобная методология используется также при

разработке генотерапевтических подходов для лечения некото-

рых ненаследственных, в частности онкологических заболева-

ний (см Главу IX).

Весьма многообещающим методом моделирования представля-

ется направленное выключение работы определенных генов путем

введения в доимплантационные зародыши антисмысловых мРНК.

Такой подход был применен, в частности, при попытке модели-

рования болезни Гоше - лизосомного заболевания, обусловлен-

ного дефицитом бета-глюкуронидазы (Bevilacqua et al., 1988).

Естественно, что в этом случае выключение экспрессии гена

носит транзиторный характер, то есть моделью, по-сути, явля-

ется само животное - реципиент антисмысловой мРНК матрицы.

Другой пример экспериментального моделирования основан

на пересадке тканей или клеток атимусным иммунодефицитным

мышам nu/nu. У мышей этой линии в связи с отсутствием тимуса

и выраженным врожденным иммунодефицитом не происходит оттор-

жение трансплантированных чужеродных тканей. Более того, у

таких животных может происходить дифференцировка трансплан-

тированных подкожно эмбриональных зачатков и регенерация пе-

ресаженных кусочков тканей из различных органов других видов

животных и человека. Так например, кусочки трахеи крысы с

нанесенными на них клетками бронхогенного эпителия человека,

имплантированные подкожно атимусным мышам, формируют струк-

туру поверхностного эпителия, сходную с той, которая имеется

в бронхах человека. Именно таким путем мыши nu/nu были ак-

тивно использованы для анализа экспрессии мутантных вариан-

тов гена муковисцидоза человека, а также для испытания эф-

фективности коррекции этого генетического дефекта с помощью

методов генотерапии. В последнем случае мутантные эпители-

альные клетки пациентов с муковисцидозом вначале подвергали

трансфекции ретровирусными или аденовирусными векторами, не-

сущими, наряду с геном - репортером, полноразмерную кДНК

нормального гена муковисцидоза. Относительная простота по-

добных моделей и возможность генетического манипулирования с

клетками человека до их трансплантации атимусным мышам дела-

ют этот подход весьма привлекательным для решения многих

экспериментальных вопросов. Основные недостатки таких моде-

лей связаны с трудностями содержания и разведения атимусных

мышей и их низкой жизнеспособностью. Генетические линии жи-

вотных в этом отношении имеют значительные преимущества.

Раздел 8.4. Конструирование модельных генетических ли-

ний животных.

Современный уровень экспериментальной эмбриологии мле-

копитающих и современные достижения молекулярной генетики

позволяют осуществлять направленное получение генетических

моделей наследственных болезней путем введения сайт-специфи-

ческих модификаций в геном млекопитающих. Такой значительный

качественный прорыв в генетическом моделировании стал возмо-

жен благодаря появлению принципиально новой технологии мани-

пулирования с ранними зародышами млекопитающих. Особенно

важными в этом отношении оказались два новых методических

подхода: получение зародышей-химер, состоящих из клеточных

клонов разных зигот, путем введения тотипотентных клеток в

полость бластоцисты (Gardner, 1978) и разработка технологии

культивирования клеточных векторов, так называемых эмбрио-

нальных стволовых клеток (Evans, Kaufman, 1981). С другой

стороны, появились методы сайт-специфического переноса кло-

нированных последовательностей ДНК в геном эукариот, осно-

ванные на отборе клеточных клонов, в которых после трансфек-

ции происходит инсерция экзогенной ДНК в гомологичном сайте

геномной ДНК без какого-либо нарушения последовательности

ДНК в месте встраивания.

Конструированию генетических моделей должны предшество-

вать идентификация и сравнительный анализ двух гетерологич-

ных генов - гена человека, вследствие нарушения работы кото-

рого развивается моделируемое заболевание, и его гомолога у

выбранного для моделирования животного. При выборе обьекта

моделирования, в первую очередь, руководствуются методичес-

кими возможностями экспериментального манипулирования с жи-

вотными. Важное значение имеет сходство кодирующих областей

гетерологичных генов по нуклеотидным последовательностям. В

большинстве случаев мыши представляются наиболее удобным

обьектом для моделирования. Современный алгоритм формирова-

ния генетической линии животных с мутациями в заданном гене

предполагает: (1) наличие культур тотипотентных, то есть

способных к неограниченному развитию и дифференцировке, эмб-

риональных стволовых клеток; (2) создание на базе рекомби-

нантных ДНК генно-инженерных конструкций для направленного

переноса генов; (3) трансфекцию этих конструкций в культуры

эмбриональных стволовых клеток последующим скринингом и от-

бором клонов со специфическими генетическими модификациями;

(4) введение отобранных модифицированных клеток в зародыш на

стадии бластоцисты по методу Гарднера с целью получения хи-

мерных трансгенных животных; (5) отбор химерных особей, не-

сущих модифицированные гены в различных тканях и органах;

(6) селекцию особей, гетерозиготных по данной мутации; (7)

инбредное разведение и селекцию гомозигот (Рис.8.1).

Как упоминалось ранее, идеальной системой для направ-

ленного переноса мутаций в геном млекопитающих являются эмб-

риональные стволовые клетки - ЭСК (Evans, Kaufman, 1981;

Erickson, 1988; Labosky et al., 1994). Первичные культуры

этих клеток получают из клеток бластоцисты (внутренней кле-

точной массы) или из первичных половых клеток ранних пос-

тимплантационных зародышей. При выращивании на питательном

слое из эмбриональных фибробластов ЭСК сохраняются в недиф-

ференцированном состоянии от трех месяцев до года. При этом

они могут быть несколько раз заморожены и оттаяны без потери

способности к дифференцировке. ЭСК, введенные в бластоцель

(полость бластоцисты), сохраняют свою тотипотентность и мо-

гут участвовать в формировании, практически, всех эмбрио-

нальных зачатков и органов развивающегося зародыша. В ре-

зультате образуется животное - химера, состоящее из клеточ-

ных клонов двух разных типов: клеток исходного родительского

генотипа и ЭСК. Если эти клетки различаются, например, по

генам окраски шерсти, животное - химера будет иметь попереч-

ную или пятнистую окрашенность. При этом все животные, неза-

висимым образом полученные в результате введения в одинако-

вые по генотипу зародыши одной и той же линии клеток, будут

отличаться друг от друга по характеру пятнистости, так как

все химеры различны по набору клеточных клонов, развившихся

и дифференцировавшихся из введенных в зародыш ЭСК. Химерные

животные, у которых ЭСК дифференцировались в половые клетки

и дали начало полноценным зрелым гаметам будут устойчиво пе-

редавать своим потомкам генетическую информацию, содержащую-

ся в ЭСК. Таких животных ингда называют зародышевыми транс-

миттерами. При скрещивании их с мышами дикого типа часть по-

томков будет уже гетерозиготна по мутантным генам ЭСК, то

есть будут нести мутацию в гаплоидном состоянии в каждом ти-

пе клеток. Это в равной степени относится и к мутациям, ис-

кусственно введенным предварительно в ЭСК. Скрещивая таких

гетерозигот, можно получить животных, гомозиготных по задан-

ной мутации. Естественно, последнее достижимо только в том

случае, если мутация не окажется летальной в гомозиготном

состоянии у животных этого вида.

Возможность вести селекцию нужных мутантных или

трансгенных клонов ЭСК и лишь затем их использовать в ка-

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14