: Литература - Другое (книга по генетике)

: Литература - Другое (книга по генетике)

честве клеточных векторов нашло широкое применение в генети-

ческом моделировании. Первоначально для этой цели ЭСК обра-

батывали различными мутагенами (этилнитрозомочевиной) отби-

рали клоны клеток, несущих мутацию в нужном гене, и затем

использовали их для создания инъекционных химер по Гарднеру.

Таким способом на мышах была получена модель болезни Леш-Ни-

хана - мутация гена гипоксантин-фосфорибозил-трансферазы

(Hooper et al.,1987). C разработкой технологии адресной

доставки чужеродной ДНК в гены-мишени этот способ генети-

ческого моделирования стал особенно эффективным. Сайт-специ-

фическая модификация генов ЭСК достигается за счет гомоло-

гичной рекомбинации между экзогенной и хромосомной ДНК. При

трансфекции большая часть проникших в ядра молекул рекомби-

нантной ДНК сохраняется там в течение двух-трех дней в виде

кольцевых эписом и в дальнейшем теряется либо происходит ин-

теграция трансфецирующей плазмиды в геном клетки- хозяина

путем негомологичной рекомбинации, то есть в случайные сайты

хромосомной ДНК. В таких клетках экспрессия введенных генов

устойчиво сохраняется. Частота интеграции экзогенной ДНК мо-

жет быть повышена при использовании линейных плазмид и спе-

циальных, преимущественно, ретровирусных векторов экзогенной

ДНК (см. Главу IX). Случаи стабильной интеграции экзогенной

ДНК могут быть легко выявлены, если трансфецирующие плазмиды

или вектора содержат селектируемый маркерный ген. Чаще всего

в качестве маркера используют прокариотический ген neo, со-

общающий клеткам устойчивость к неомицину. Клетки, в которых

произошла интеграции такой плазмиды в хромосомную ДНК, будут

образовывать устойчивые клоны при выращивании на среде G418,

содержащей неомицин, в то время как все другие клоны клеток

будут в этих условиях деградировать.

Раздел 8.5. Методы направленного переноса генов.

Наиболее важным шагом на пути искусственного получения

мутантной линии животных является отбор клонов ЭСК с

сайт-специфической модификацией определенного гена. Однако,

случаи инсерции экзогенной ДНК в ген-мишень очень редки, их

общая частота, обычно, не превышает 10-6. Предпринимаются

попытки генетической модификации ЭСК с тем, чтобы повысить в

них частоту гомологичной рекомбинации. Идентифицированы не-

которые гены, контролирующие этот процесс у мышей и у чело-

века. Однако, в любом случае схемы направленной модификации

генов должны включать селекцию нужных клонов клеток. Впервые

направленная сайт-специфическая модификация была выполнена

также на гене гипоксантин-фосфорибозил-трансферазы (см.выше)

и была получена еще одна генетическая линия мышей, моделиру-

ющая вызванную дефектом в HPRT-гене болезнь Леш-Нихана у че-

ловека (Thomas, Capecci, 1987). Успех этих исследований, в

первую очередь, обусловлен существованием простых схем отбо-

ра клеток с функционирующим и нефункционирующим HPRT-геном

на селективных средах. Важно также, что этот ген локализован

в X-хромосоме и в ХУ-клетках он представлен одной копией.

При этих условиях случаи модификации гена, вызванные инсер-

цией экзогенной ДНК в правильном положении, легко идентифи-

цируются - Рис.8.1 (см. Главу X).

В настоящее время предложено несколько вариантов для

направленного переноса неселектируемых генов за счет допол-

нительной инсерции в трансфецирующую плазмиду селектируемого

маркерного гена в таком положении, при котором его экспрес-

сия происходит преимущественно при правильном встраивании

векторной последовательности в ген-мишень (рис.8.2). Так,

маркерный ген neo, помещенный в инсертируемую область ДНК

плазмиды без собственного промотора, может экспрессироваться

только находясь под контролем какого-либо другого промотора

хромосомной ДНК. Для этого инсерция экзогенной ДНК должна

произойти в область гена-мишени без сдвига рамки считывания.

При случайной интеграции экспрессии маркерного гена не будет

Таким образом, отбор неомицин-устойчивых клеток приведет к

резкому увеличению частоты клонов, в которых произошла гомо-

логичная рекомбинация между зкзогенной и геномной ДНК. На

этом же принципе основано использование генетических конс-

трукций с геном neo, не содержащим поли-А последовательности

в 3' области. Дальнейший поиск гомологичных рекомбинантов

среди G418-устойчивых клеток проводят путем блот-гибридиза-

ции, используя в качестве ДНК-зонда фрагмент векторной пос-

ледовательности, расположенный вне направленно переносимого

участка экзогенной ДНК.

Особенно перспективным на сегоднешний день представля-

ется метод позитивно-негативной селекции (Melton, 1994). Ме-

тод сочетает отбор клеток, в которых произошла интеграция

экзогенной ДНК, с селективной элиминацией тех из них, где

встраивание произошло за счет негомологичной рекомбинации.

Для этого маркерный селектируемый ген neo с регуляторными

последовательностями инсертируют в переносимую область ДНК

плазмиды, а вне этой области встраивают условно летальный

вирусный ген тимидинкиназы герпеса (HSV-tk). При интеграции

такого вектора в геномную ДНК путем гомологичной рекомбина-

ции HSV-tk ген не инкорпорируется в хромосому, тогда как при

негомологичной рекомбинации этот ген будет присутствовать в

неомицин-устойчивых клетках. Обработка таких клеток противо-

герписным агентом - ганцикловиром, будет сопровождаться ги-

белью всех клонов, экспрессирующих вирусную тимидинкиназу

(Рис.8.3).

Отбор клеток с модифицированным геном также может про-

изводиться с помощью ПЦР. При этом не используют какие-либо

маркерные гены и/или селектируемые среды. Олигопраймеры для

амплификации выбирают таким образом, что один из них гомоло-

гичен соседней с сайтом интеграции последовательности моди-

фицируемого гена, а другой соответствует участку инсертируе-

мой экзогенной ДНК (Рис.8.4). Метод позволяет обнаруживать

присутствие пяти правильно модифицированных клеток среди

50 000. После трансфекции клетки разделяются на группы, в

каждой из которых проводят тестирование с помощью ПЦР. При

положительном ответе группу клеток разбивают на подгруппы и

процедуру повторяют до тех пор, пока не удается изолировать

нужные клоны.

Направленное выключение генов-мишеней может быть достиг-

нуто несколькими способами. Так называемые, нулевые мутации

могут быть получены путем встраивания плазмиды, содержащей,

наряду с экзонными последовательностями модифицируемого гена

и селектируемым маркерным геном, сильные транскрипционные и

трансляционные стоп-сигналы. При этом в разрушенном за счет

инсерции экзоне транскрипция прекращается, в результате чего

образуется укороченный белок, незащищенный от действия кле-

точных протеаз.

Более совершенной является разработанная недавно техни-

ка двойной замены гена. Для этого используют ЭСК, дефицитные

по ферменту HPRT - НМ1 (Melton, 1994). На первом этапе

ген-мишень инактивируют путем замены одного из экзонов и

прилежащих последовательностей на HPRT мини-ген. При этом в

нокаутирующем векторе HPRT маркер фланкируется ДНК последо-

вательностями, гомологичными месту вставки в ДНК гена-мише-

ни. В этот же вектор включен и ген вирусной тимидинкиназы

(Рис.8.5). После трансфекции отбираются клетки позитивные по

HPRT и негативные по вирусной тимидин-киназе. Именно в таких

клетках с высокой степенью вероятности произошла гомологич-

ная рекомбинация с заменой одного из экзонов на инсертиро-

ванный мини-ген HPRT. Факт такого встраивания доказывается

при помощи ПЦР. На следующем этапе инсертированный HPRT ми-

ни-ген заменяют на отсутствующий фрагмент гена-мишени, в ко-

торый предварительно вносят интересующие исследователя мута-

ции. При этом альтернативный вектор несет те же фланкирующие

ДНК-последоваельности гена-мишени, что и первый (нокаутирую-

щий) вектор. Клетки HPRT минус на этом, 2- м этапе с большой

вероятностью будут нести гомологичную рекомбинацию встроен-

ной конструкции мини-HPRT гена и альтернативного фрагмента

исходного гена. Факт такой рекомбинации контролируется с по-

мощью ПЦР. Таким образом, вместо обычного выключения функции

гена, что достигается уже на 1-м этапе, данная технология

позволяет вносить в структуру гена дикого типа различные,

заранее спланированные изменения, в том числе и специфичес-

кие мутации, аналогичные таковым при наследственных болезнях

у человека. Следовательно, данный подход позволяет проводить

более тонкое генетическое моделирование и исследовать осо-

бенности функции мутантного гена in vivo.

Для введения специфических мутаций в определенные экзо-

ны гена используют, так называемые "hit & run" векторы (Has-

ty et al., 1991). Перспективным также представляется исполь-

зование дрожжевых YAC-векторов, несущих полноразмерные

кДНК-овые последовательности гена. Так как уровень гомоло-

гичной рекомбинации у дрожжей достаточно высок, в такие

конструкции легко вводить специфические мутации и затем ис-

пользовать их для трансфекции ЭСК и получения трансгенных

животных 4.

Отбор клонов эмбриональных стволовых клеток, в которых

произошла направленная модификация гена-мишени, в значитель-

ной степени, предопределяет успех всего комплекса работ по

созданию модельной генетической линии. Однако, и дальнейшие

этапы этой программы, включающие получение химерных транс-

генных животных, идентификацию зародышевых трансмиттеров

(химер, продуцирующих трансфецированные половые клетки) и

селекцию гетерозиготных, а затем гомозиготных мутантнах осо-

бей, требуют большой квалификации, труда и времени. Осложня-

ющим обстоятельством является то, что химерные животные не-

редко имеют сниженную жизнеспособность и плодовитость. То же

может быть справедливо и в отношении гетерозиготных мутант-

ных особей. В гомозиготном состоянии инсертированные мутации

могут не только снижать жизнеспособность и плодовитость, но

и обладать летальным или полулетальным эффектом уже в прена-

тальном периоде. В таком случае линия поддерживается путем

отбора и скрещивания гетерозигот.

Несмотря на огромные методические сложности и высокую

стоимость, направленное получение моделей наследственных бо-

лезней оправдывает затраченные усилия. Мутантные животные

представляют уникальную возможность исследовать патофизиоло-

гические процессы, развивающиеся в организме вследствие на-

рушений работы определенного гена, анализировать влияние

специфических мутаций на фенотип, тестировать новые лекарс-

твенные препараты и испытывать различные терапевтические

подходы. Велика также роль генетических линий в разработке

методов генной терапии (см. Главу IX).

ГЛАВА IY.

ТИПЫ И НОМЕНКЛАТУРА МУТАЦИЙ. МЕТОДЫ ДНК- ДИАГНОСТИКИ.

Раздел 4.1 Мутантные аллели, характеристика и типы му-

таций.

Каждый генетический локус характеризуется определенным

уровнем изменчивости, то есть присутствием различных аллелей

или вариантов последовательностей ДНК у разных индивидуумов.

Применительно к гену, аллели разделяются на две группы -

нормальные, или аллели дикого типа, при которых функция гена

не нарушена, и мутантные, приводящие к нарушению работы ге-

на. В любых популяциях и для любых генов аллели дикого типа

являются преобладающими. Под мутацией понимают все изменения

в последовательности ДНК, независимо от их локализации и

влияния на жизнеспособность особи. Таким образом, понятие

мутации является более широким по сравнению с понятием му-

тантного аллеля. Уместно, однако, заметить, что в научной

литературе сравнительно часто встречающиеся в популяциях ва-

рианты последовательностей генов, не приводящие к заметным

нарушениям функций, обычно рассматриваются как нейтральные

мутации или полиморфизмы, тогда как понятия "мутация" и "му-

тантный аллель" зачастую употребляются как синонимы.

Как упоминалось ранее, различные изменения в нуклеотид-

ной последовательности транскрибируемых областей ДНК могут

по-разному проявляться в фенотипе. Часть из них не оказывает

никакого влияния на структуру и функцию соответствующего

белка. Примером могут служить замены нуклеотидов, не приво-

дящие к замене аминокислот в силу вырожденности генетическо-

го кода. Мутантные аллели, в свою очередь, могут быть под-

разделены на три класса: (1) мутации, ведущие к полной поте-

ре функции (loss-of-function), (2) мутации, сопровождающиеся

количественными изменениями соответствующих мРНК и первичных

белковых продуктов и (3) доминантно-негативные мутации, из-

меняющие свойства белковых субъединиц таким образом, что они

оказывают повреждающий эффект на жизнеспособность или функ-

ционирование экспрессирующих типов клеток (gain-of-function

мутации). Наибольшим повреждающим действием обладают мута-

ции, приводящие либо к образованию бессмысленного белка, ли-

бо к преждевременному окончанию его синтеза, то есть делеции

или инсерции, не кратные трем нуклеотидам и потому вызываю-

щие сдвиг рамки считывания, а также нонсенс мутации - замены

нуклеотидов, при которых образуются терминирующие стоп-кодо-

ны. Проявление таких мутаций зависит от их внутригенной ло-

кализации. Чем ближе мутации к 5' концу гена, то есть к на-

чалу транскрипции, тем короче их белковые продукты. Такие

абортивные (truncated) белки неспособны к модификациям и

быстро деградируют.

Фенотипическое проявление замен нуклеотидов в кодо-

нах, так нназываемых миссенс мутаций, зависит от природы

соответствующих аминокислотных замен в белке и от функцио-

нальной значимости того домена, в котором это произошло.

Так, замены аминокислот в активных центрах белков могут соп-

ровождаться полной потерей его функциональной активности,

тогда как даже значительно более серьезные нарушения в дру-

гих частях белка часто оказывают существенно меньшее влияние

на фенотип. Мутации на стыке экзонов и интронов (так называ-

емые сплайсинговые мутации) часто нарушают процессинг пер-

вичного РНК-транскрипта, в результате чего происходит либо

неправильное вырезание соответствующей интронной области и

трансляция бессмысленного удлиненного белка, не защищенного

от протеолитического действия внутриклеточных ферментов, ли-

бо вырезание экзонов и образование делетированного белка. В

обоих случаях сплайсинговые мутации, как правило , обуслав-

ливают тяжелое течение болезни. Нарушения в регуляторных об-

ластях генов сопровождаются количественными изменениями

соответствующего продукта и не затрагивают структуры и функ-

циональной активности белка. Проявление таких мутаций опре-

деляется, в конечном счете, пороговым уровнем концентрации

белка, при котором его функция еще сохраняется. Как правило,

регуляторные мутации менее серьезны и обладают более выра-

женным плейотропным (множественым) эффектом по сравнению с

мутациями структурных генов.

Относительно недавно выявлен новый класс так называемых

динамических мутаций, или мутаций экспансии, связанных с

нестабильностью числа тринуклеотидных повторов в функцио-

нально значимых частях генов. Многие тринуклеотидные повто-

ры, локализованные в транскрибируемых или регуляторных об-

ластях генов, характеризуются высоким уровнем популяционной

изменчивости, в пределах которого не наблюдается фенотипи-

ческих нарушений (Willems,1994). Болезнь развивается лишь

тогда, когда число повторов в этих сайтах превосходит опре-

деленный критический уровень. Наследование таких мутаций,

как правило, отличается от классического Менделевского ти-

па. Для них характерны: различная пенетрантность в сочетании

с неполным доминированием; геномный импринтинг (различия фе-

нотипических проявлений в зависимости от того, получена му-

тация от матери или от отца) и феномен антиципации - на-

растание тяжести проявления заболевания в последующих поко-

лениях (Willems,1994).

Классическим примером мутаций экспансии является синд-

ром ломкой Х-хромосомы (FraXA), обусловленный присутствием

удлиненных CCG повторов в 5'-нетранслируемой регуляторной

области FMR1-гена (Xq27.3). Аналогичные нестабильные повторы

обнаружены еще в трех ломких сайтах, причем два из них

(FraXE и FraXF) расположены на очень небольшом расстоянии

дистальнее FraXA. Во всех четырех случаях CCG-повторы лока-

лизованы вблизи от CpG островков, при этом увеличение числа

копий триплетов выше определенного порогового уровня сопро-

вождается гиперметилированием всей регуляторной GC-богатой

области, вследствие чего и происходит резкое снижение и

полное выключение транскрипционной активности - мутации по

типу " утраты функции" (loss-of-functions). Таким образом,

область CCG-повторов в этих локусах можно рассматривать, как

своеобразный cis-действующий элемент транскрипции (Willems,

1994, Mandel,1994).

Другой тип динамических мутаций описан для 6-ти раз-

личных тяжелых аутосомно-доминантных нейродегенеративных

расстройств (см. Главу X). Для всех этих заболеваний обнару-

жено присутствие удлиненных CAG-повторов в открытой рамке

считывания (ORF). Эти повторы транслируются в протяженные

полиглютаминовые треки, предположительно локализованные в

ДНК- связывающих доменах соответствующих белковых продуктов.

В результате белковые молекулы приобретают новые свойства,

нарушающие нормальные метаболические связи. Таким образом,

нестабильные CAG-повторы можно рассматривать, как

gain-of-function - мутации. Интенсивно обсуждается также

возможность участия амплификации CAG-повторов в формировании

предрасположенности к таким частым расстройствам центральной

нервной системы, как шизофрения и маниакально-депрессивный

психоз. Примером третьей группы болезней экспансии служит

миотоническая дистрофия. При этом заболевании огромные CTG

(или CAG) повторы локализованы в 3'-нетранслируемой области

гена. Они также рассматриваются, как факторы, нарушающие

нуклеосомную организацию гена и подавляющие его транскрипцию

Более подробно болезни экспансии рассмотрены в Главе X.

Раздел 4.2. Генетическая гетерогенность наследственных

заболеваний.

Одним из важных обобщающих итогов молекулярно-генети-

ческих исследований моногенных болезней явилось доказа-

тельство их генетической гетерогенности. Последняя может

быть вызвана разными причинами. Прежде всего, оказалось, что

один и тот же биохимический эффект (фенотип) может быть

обусловлен мутациями в разных генах. С другой стороны, мута-

ции одного и того же гена, как установлено, могут приводить

к совершенно разным клиническим проявлениям. Например, мута-

ции гена адренорецептора, сцепленого с Х-хромосомой, могут

быть причиной нейродегенеративного заболевания - болезни

Кеннеди, если они захватывают область тринуклеотидных повто-

ров (Глава X), и в то же время приводить к синдрому тестику-

лярной феминизации, то есть нарушениям половой дифференци-

ровки, если они затрагивают другие последовательности этого

же гена. Крайним выражением такой гетерогенности может слу-

жить пример с геном рецептора тирозинкиназы -RET, различные

мутации которого могут приводить к 4-м совершенно различным

наследственным синдромам, таким как семейная медуллярная

карцинома щитовидной железы, болезнь Гиршпрунга, множествен-

ная эндокринная неоплазия тип 2А (МЭН-2А) и тип 2B (МЭН-2B)

(Hayningen,1994). Подобные фенотипические разнообразия про-

явлений мутаций одного и того же гена получили название ал-

лельных серий. Термин используется уже около 20 лет для

описания групп из нескольких моногенных наследственных забо-

леваний, клинические проявления которых позволяют предпола-

гать их связь с разными генами, в то время как биохимические

и/или генетические исследования доказывают их аллельную при-

роду, то есть в основе их патогенеза лежат разные мутации

одного и того же гена.

В настоящее время известно более 100 таких болезней

(Romeo, McKusick, 1994). Для каждого заболевания из подобной

серии аллелизм мутаций уже доказан на молекулярном уровне.

Причины подобного фенотипического разнообразия могут быть

различными: (1) локализация мутантных аллелей в функциональ-

но разных доменах белка; (2) принципиально разный механизм

действия мутаций (loss-of-function, gain-of-function); (3)

присутствие в том же гене модифицирующего мутантного аллеля

или полиморфизма и (4) влияние генетического окружения на

проявление мутантного аллеля, то есть его взаимодействие с

определенными аллелями гена-модификатора или даже нескольки-

ми такими генами. Углубленный молекулярно-генетический ана-

лиз практически каждого наследственного заболевания указыва-

ет на его значительную генетическую гетерогенность, связан-

ную с различными мутациями гена. Некоторые примеры аллельных

серий и генетической гетерогенности заболеваний будут

рассмотрены более подробно в Главе X.

Раздел 4.3 Номенклатура мутаций.

Для практических целей и, главным образом, для чтения

научной литературы, важно знать, как записываются мутации.

До недавнего времени единой номенклатуры записи мутаций не

существовало. В 1992 г. двумя американскими учеными Артуром

Боде и Лап-Чи Тсуи была предложена универсальная стандартная

система для обозначения разных мутаций (Beudet, Lap-Сhee

Tsui, 1993). Она рассчитана как на запись аминокислотных за-

мен в белках, так и на нуклеотидные замены и перестановки в

ДНК. В первом случае, каждой аминокислоте соответствует од-

нобуквенный символ (Табл.4.1), слева записывается нормальный

вариант аминокислоты, справа - мутантный, а расположенный в

центре номер соответствует месту замены в цепочке первичного

продукта трансляции. Например, запись D44G означает замену

аспарагина на глицин в 44-м положении полипептидной цепи, а

A655E - аланина на глутамин в пложении 655 белкового продук-

та. Так записываются различные варианты аминокислотных замен

при миссенс мутациях. Буквой Х обозначается место остановки

синтеза полипептидной цепи при нонсенс мутациях. Например,

Q39X означает замену глицина на стоп сигнал в 39-м кодоне, а

W1282X - триптофан-триплета на стоп-кодон в положении 1282.

Отсутвие одной или нескольких аминокислот обозначают значком

^-дельта. Так, наиболее частая мутация, приводящая к муко-

висцидозу- ^F508 - означает отсутствие фенилаланина в 508

положении трансмембранного регуляторного белка муковисцидо-

за. Полиморфизмы, связанные с равноценной по функциональной

значимости заменой аминокислот, записывают через черточку.

Например, M/V470 - метионин или валин в положении 470.

Таблица 4.1. Символы аминокмслот.

------------------------T-----------------T--------------¬

¦ Аминокислоты 1¦ 0 Трехбуквенный 1¦ 0 Однобуквенный 1¦

¦ 1¦ 0 символ 1¦ 0 символ 1 ¦

+-----------------------+-----------------+--------------+

¦ Аланин 1¦ 0 Ala 1¦ 0 A 1 ¦

¦ Аргинин 1¦ 0 Arg 1¦ 0 R 1 ¦

¦ Аспарагин 1¦ 0 Asn 1¦ 0 N 1 ¦

¦ Аспарагиновая кислота 1¦ 0 Asp 1¦ 0 D 1 ¦

¦ Asn и/или Asp 1¦ 0 Asx 1¦ 0 B 1 ¦

¦ Цистеин 1¦ 0 Cys 1¦ 0 C 1 ¦

¦ Глутамин 1¦ 0 Gln 1¦ 0 Q 1 ¦

¦ Глутаминовая кислота 1¦ 0 Glu 1¦ 0 E 1 ¦

¦ Gln и/или Glu 1¦ 0 Glx 1¦ 0 Z 1 ¦

¦ Глицин 1¦ 0 Gly 1¦ 0 G 1 ¦

¦ Гистидин 1¦ 0 His 1¦ 0 H 1 ¦

¦ Изолейцин 1¦ 0 Ile 1¦ 0 I 1 ¦

¦ Лейцин 1¦ 0 Leu 1¦ 0 L 1 ¦

¦ Лизин 1¦ 0 Lys 1¦ 0 K 1 ¦

¦ Метионин 1¦ 0 Met 1¦ 0 M 1 ¦

¦ Фенилаланин 1¦ 0 Phe 1¦ 0 F 1 ¦

¦ Пролин 1¦ 0 Pro 1¦ 0 P 1 ¦

¦ Серин 1¦ 0 Ser 1¦ 0 S 1 ¦

¦ Треонин 1¦ 0 Thr 1¦ 0 T 1 ¦

¦ Триптофан 1¦ 0 Trp 1¦ 0 W 1 ¦

¦ Тирозин 1¦ 0 Tyr 1¦ 0 Y 1 ¦

¦ Валин 1¦ 0 Val 1¦ 0 V 1 ¦

L-----------------------+-----------------+---------------

Принципиальная схема записи и нумерации нуклеотидов

приведена на Рис.4.1. Отсчет нуклеотидов в молекуле ДНК на-

чинается с первого смыслового кодона, так что нуклеотид под

номером +1 соответствует первому нуклеотиду в молекуле кДНК.

Вверх по течению (или справа налево от 3' к 5'-концу) от

первого кодона нуклеотиды записывают со знаком "-", вниз по

течению (от 5 'к 3') - со знаком "+". Для многих генов

отсутствие точных данных о положении инициирующего сайта и

наличие нескольких мест инициации транскрипции существенно

затрудняют нумерацию нуклеотидов. Нуклеотиды экзонов обозна-

чают заглавными буквами, интронов - прописными.

В Табл.4.2. даны примеры обозначения различных мутаций

с использованием как аминокислотной, так и нуклеотидной ну-

мерации. Нуклеотидная система записи особенно важна для

обозначения делеций, инсерций, сплайсинговых мутаций и поли-

морфизмов, не связанных с заменами аминокислот или происхо-

дящими в нетранслируемых частях гена. В случае делеции или

инсерции одного или двух нуклеотидов приводится их буквенное

обозначение. Например, 441delA, 485insTA. При делеции или

инсерции трех и более нуклеотидов указывается только их

число. Так, 852del22 означает делецию 22 нуклеотидов, начи-

ная с 852-го нуклеотида, а 3320ins7 обозначает вставку 7 пар

оснований после нуклеотида 3320. В случае больших вставок

или делеций их размеры указыаются в килобазах, например

2115ins13kb, или обозначаются соответствующие инсертирован-

ные/ делетированные структурные элементы генома. Так,

2115insAlu означает инсерцию Alu-повтора после нуклеотида

2115. При обозначении сплайсинговых мутаций записывают номер

крайнего нуклеотида в ближайшем к мутации экзоне, число нук-

леотидов (со знаком "+" в случае 3' конца экзона и со знаком

"-" в случае 5' конца) и характер нуклеотидной замены.

(Рис.4.1, Таб.4.2). Например, 711+5G-T обозначает замену G

на Т в 5-м основании интрона, следующего за экзоном, закан-

чивающимся 711 нуклеотидом.

Раздел 4.4. Идентификация структурных мутаций, изоляция му-

тантных ДНК.

Идентификация мутантных аллелей, то есть обнаружение

нарушений в первичной нуклеотидной последовательности ДНК,

является самым прямым методом молекулярной диагностики

наследственных заболеваний. Большие перестройки - делеции,

дупликации, инверсии, транслокации - размером более 1 Мb,

затрагивающие целые гены или даже несколько генов, могут

быть обнаружены на цитологических препаратах с использовани-

ем техники высокого разрешения хромосомного анализа (анализ

дифференциально окрашенных прометафазных хромосом). Еще боль-

шая разрешающая способность (до 50 кb) может быть достигнута

при работе на специальным образом приготовленных (растяну-

тых) интерфазных хромосомах с использованием техники гибри-

дизации in situ (FISH - Глава II).

Мутации, изменяющие длину рестрикционных фрагментов,

могут быть выявлены путем блот-гибридизации рестрицированной

геномной ДНК с соответствующими ДНК-зондами на стадиях гене-

тического анализа, предшествующих молекулярному клонированию

гена. К числу таких мутаций относятся достаточно протяжен-

ные, но не идентифицируемые цитогенетически, внутригенные

делеции, инсерции и дупликации, а также точечные мутации,

локализованные в сайтах рестрикции. Непременным условием ре-

ализации метода блот-гибридизации для поиска подобных мута-

ций является наличие ДНК-зонда, являющегося либо частью ге-

на, либо тесно сцепленной с этим геном клонированной

ДНК-последовательностью. При поиске таких мутаций геномную

ДНК от здорового донора и больного обрабатывают часто щепя-

щими рестриктазами, подвергают электрофорезу, блот-гибриди-

зации с меченым ДНК-зондом по стандартной схеме (Глава I) и

проводят сравнительный анализ расположения бэндов на ради-

оавтографе. Особенно информативными обычно оказываются рест-

риктазы Msp1 и Taq1, которые узнают сайты CGGG и TGGA, соот-

ветственно. Благодаря наличию СpG последовательностей эти

сайты особенно часто подвергаются спонтанному мутированию

(см.раздел 4.5). Наличие протяженных делеций, либо точечных

мутаций в сайтах рестрикции приводит к изменениям размеров

рестрикционных фрагментов. Целенаправленный поиск других то-

чечных мутаций (не затрагивающих сайты рестрикции) и неболь-

ших структурных аномалий возможен только для клонированных

генов с известной нуклеотидной последовательностью смысловых

участков ДНК. Методы идентификации подобных мутаций основа-

ны, главным образом, на использовании полимеразной цепной

реакции в её различных модификациях (см.Главу I, а также

разделы 4.5 и 4.6).

Для анализа мутантных аллелей, прежде всего, необходимо

иметь изолированные последовательности мутантного гена, ко-

торые могут быть получены либо путем клонирования или ампли-

фикации мутантной кДНК, либо за счет специфической амплифи-

кации отдельных экзонов, их частей и регуляторных областей

гена с использованием в качестве матрицы геномной ДНК паци-

ентов (Рис. 4.2). В первом случае отбирают клонированные

к-ДНК-последовательности мутантного гена, проводя скрининг

кДНК-овых библиотек, сконструированных из специфических тка-

ней или культур клеток больного. При этом в качестве зондов

используют кДНК-овые последовательности нормального гена.

Другим источником кодирующих последовательностей мутантного

гена может служить мРНК, изолированная из экспрессирующих

тканей или клеток больного. Мутантную кДНК получают путем

специфической амплификации перекрывающихся последователь-

ностей кодирующих областей гена, используя в качестве матри-

цы тотальную кДНК, полученную при обратной транскрипции изо-

лированной мРНК. Преимуществом этого подхода является то,

что праймеры для амплификации выбирают из экзонных областей,

нуклеотидные последовательности которых, как правило, стано-

вятся известны вскоре после идентификации и клонирования ге-

на. В ряде случаев изоляция мутантной мРНК затруднена в свя-

зи с недоступностью образцов тканей или органов, в которых

происходит экспрессия нужного гена (мозг, печень и др.). Од-

нако, обнаружение следовых количеств, так называемой, неза-

конной или эктопической мРНК во многих клетках и тканях, в

том числе в клетках крови, позволяет преодалевать и эти

трудности (Kaplan et al., 1992). Успех подобной процедуры

получения мутантной кДНК связан, в первую очередь, с разра-

боткой эффективных методов выделения и обратной транскрипции

мРНК с сохранением всех типов кДНК, включая те, для которых

соответствующие мРНК присутствуют в ничтожных концентрациях

(например, мРНК дистрофина при мышечной дистрофии Дюшенна

(см.Главу X). Единственным принципиальным ограничением мето-

дов детекции мутаций в кДНК-овых последовательностях явля-

ются невозможность выявления мутаций в регуляторных и инт-

ронных частях гена. Подобные мутации могут быть выявлены

только при анализе геномной ДНК пациента.

Получение геномной мутантной ДНК обычно не представляет

сложностей, так как она может быть изолирована из любых кле-

ток или тканей больного независимо от характера экспрессии

исследуемого гена. Однако, амплификация целых экзонов воз-

можна только при знании нуклеотидных последовательностей

фланкирующих интронных областей, из которых и производят

подбор специфических олигопраймеров. Секвенирование интронов

представляет собой достаточно трудоемкую задачу, решенную

далеко не для всех клонированных генов. Таким образом, к ог-

раничениям этого подхода следует отнести необходимость

достаточно полной информации о структуре гена и о его пер-

вичной нуклеотидной последовательности. Кроме того, объектом

тестирования могут быть лишь сравнительно небольшие области

гена, отсюда для получения более полной информации необходи-

ма амплификация многих экзонов.

Стратегия идентификации мутаций может быть различной и,

в конечном счете, определяется тем, имеем ли мы дело с ранее

неизвестными мутациями, либо целью анализа является скрини-

рование уже известных мутаций. В первом случае обектом

исследования чаще всего служат клонированные или амплифици-

рованные кДНК-овые последовательности, тогда как при молеку-

лярной диагностике известных мутаций, как правило, анализи-

руют амплифицированные фрагменты геномной ДНК.

Раздел 4.5. Первичная идентификация точечных мутаций.

Любые типы мутаций могут быть обнаружены путем прямого

секвенирования мутантной кДНК или отдельных экзонов и часто

первичный поиск нарушений в кодирующих областях гена осу-

ществляют именно таким образом. Сам метод секвенирования уже

был рассматрен ранее ( см.Главу I,раздел 1.6). Для некоторых

генов, имеющих небольшие размеры, метод прямого секвенирова-

ния с успехом применяется как основной метод сканирования

мутаций. Так, в частности, особенно удобным оказалось его

применение для детекции мутаций в сравнительно небольших по

размеру генах, таких, например, как ген фактора IX свертыва-

ния крови (гемофилия В). Использование эктопической мРНК для

получения амплифицированных кДНК-овых фрагментов открывает

особенно широкие возможности для применения метода прямого

секвенирования.

Разработаные в последние годы модификации методов ПЦР

значительно облегчили секвенирование амплифицированных фраг-

ментов и повысили его эффективность. Так, в частности, пред-

ложен вариант ассиметричной ПЦР, когда при амплификации кон-

центрация одного из олигопраймеров в несколько десятков раз

превосходит концентрацию другого праймера, в результате чего

синтезируется преимущественно только одна, нужная для секве-

нирования цепочка ДНК. Для этой же цели (получения одноцепо-

чечной ДНК) предложено использование магнитных частиц с

фиксированным на их поверхности стрептавидином. При этом

один из праймеров для проведения ПЦР метится биотином. Затем

к продуктам амплификации добавляют магнитные частицы с при-

шитым стрептавидином. Благодаря прочному связыванию биотин -

стрептовидин, меченая биотином последовательность ДНК фикси-

руется на магнитных частицах. С помощью щелочного лизиса с

частиц удаляют вторую немеченую комплементарную последова-

тельность ДНК, которую и используют для секвенирования. Еще

в одном варианте амплификацию проводят в присутствии прайме-

ров, несущих сайт узнавания для фермента Т7 - РНК полимера-

зы. После амплификации в системе in vitro проводят

транскрипцию амплификата с помощью Т7-РНК полимеразы и обра-

зовавшуюся одноцепочечную РНК используют для секвенирования

- метод GAWTS (genome amplification with transcript

sequences).

Однако, в общем случае секвенирование полноразмерной

кДНК или всех экзонов для генотипирования мутаций у отдель-

ных пациентов достаточно трудоемко, дорого и требует много

времени. Поэтому на практике чаще проводят предварительный

отбор более простыми методами амплифицированных, а иногда

клонированных фрагментов ДНК, предположительно содержащих

мутации, а затем секвенируют только эти участки ДНК. Методы

поиска фрагментов ДНК, предположительно содержащих мутации,

основаны на сравнительном анализе мутантных и нормальных

последовательностей по целому ряду физических и химических

характеристик, которые в значительной степени варьируют в

зависимости от типа мутационного повреждения. Следует под-

черкнуть, что независимо от метода детекции мутации и прак-

тически независимо от её природы (замены нуклеотидов, деле-

ции, дупликации и пр.) точные молекулярные характеристики

каждой мутации могут быть получены только путем прямого сек-

венирования. При наличии в амплифицированном фрагменте из-

вестных сайтов рестрикции положение мутации может быть пред-

варительно уточнено. Для этого продукты амплификации разре-

зают соответствующей эндонуклеазой и исследуют более корот-

кие фрагменты.

Наиболее просто обнаруживаются мутации, изменяющие дли-

ну амплифицированных фрагментов, так как подобные нарушения

легко выявляются при электрофоретическом анализе. Так, про-

тяженные делеции, захватывающие целые экзоны, могут быть вы-

явлены по изменению длины рестрикционных фрагментов, гибри-

дизующихся со специфическими ДНК-зондами. Более простая и

эффективная методика выявления таких мутаций в генах, сцеп-

ленных с полом, основана на одновременной амплификации раз-

личных экзонов, наиболее часто вовлекаемых в подобные пе-

рестройки, так называемый мультиплексный вариант ПЦР. Разни-

ца в размерах и числе амплифицированных фрагментов позволяет

легко идентифицировать такие мутации на электрофорезе

(Рис.4.2). Особенно широко этот метод используется для иден-

тификации делеций в гене дистрофина, на долю которых прихо-

дится около 60% всех мутаций, приводящих к миодистрофии Дю-

шенна (см.Главу X). При отсутствии делеций все амплифициро-

ванные фрагменты после электрофоретического разделения и ок-

рашивания можно наблюдать в виде отдельных полос. Если в

исследуемой ДНК какие-то из экзонов делетированы, будут

отсутствовать и соответствующие им полосы на электрофорег-

рамме (Рис.4. 2). Выбирая специфические участки гена для ам-

плификации, можно оценить размер делеции с точностью до от-

дельных экзонов, а также определить ее внутригенную локали-

зацию.

Метод этот, однако, не обнаруживает подобные делеции,

находящиеся в гетерозиготном состоянии или локализованные в

аутосомных генах, так как нормальная гомологичная последова-

тельность геномной ДНК может служить матрицей для амплифика-

ции любых фрагментов. Данный подход применим к анализу деле-

ций в аутосомных генах только в тех случаях, когда возможно

дополнить ПЦР количественной оценкой результатов амплифика-

ции - так называемая количественная ПЦР. Оригинальный метод

идентификации подобных делеций у гетерозигот основан на

использовании в качестве матричной ДНК для ПЦР кДНК, полу-

ченной путем обратной транскрипции из эктопической мРНК или

из мРНК, изолированной из экспрессирующих данный ген тканей

или культур клеток пациента. В отличие от нормального гомо-

лога, в мутантной молекуле кДНК граничащие с делецией экзоны

сближены. Если в качестве олигопраймеров для ПЦР будут выб-

раны последовательности из этих областей гена, только му-

тантная кДНК будет служить матрицей для амплификации неболь-

шого участка между праймерами из фланкирующих делецию экзо-

нов. В нормальной последовательности кДНК этот участок может

быть слишком велик, для того чтобы прошла амплификация.

Практически, для обнаружения гетерозигот по протяженным

внутригенным делециям проводят мультиплексную ПЦР с исполь-

зованием системы олигопраймеров, обеспечивающих амплификацию

фрагментов, полностью перекрывающих всю молекулу кДНК. Нали-

чие делеции регистрируют по появлению продуктов амплификации

необычного размера.

Небольшие делеции и вставки нуклеотидов не приводят к

отсутствию амплифицированных фрагментов ДНК, но изменяют их

размеры. Эти изменения могут быть зарегистрированы при

электрофорезе продуктов амплификации в полиакриламидном или

агарозном гелях (Рис.4.3). Именно этот метод используется

для детекции наиболее часто встречающейся мутации в гене му-

ковисцидоза - делеции трех нуклеотидов ^F508. После выявле-

ния различий между нормальной и мутантной ДНК по длине рест-

рикционных или амплифицированых фрагментов гена необходимо

провести секвенирование необычного фрагмента, с целью опре-

деления изменений в первичной структуре мутантной ДНК после-

довательности по сравнению с нормальной.

При мутациях гена, представляющих собой замену одного

или нескольких нуклеотидов, длины амплифицированных фрагмен-

тов остаются постоянными, однако, некоторые физико-хими-

ческие свойства мутантных молекул ДНК меняются. Так, напри-

мер, при гибридизации однонитевых ДНК, комплементарных нор-

мальной и мутантной нитям ДНК, возникают структурные наруше-

ния в месте негомологичного спаривания. С учетом этих осо-

бенностей разработаны различные варианты поиска мутантных

фрагментов ДНК и идентификации в них точечных мутаций. Веду-

щими из этих методов являются: метод анализа конформационно-

го полиморфизма однонитевой ДНК - SSCP, денатурирующий гра-

диентный гель-электрофорез - DGGE, метод химического расщеп-

ления некомплементарных сайтов (CMC), метод гетеродуплексно-

го анализа (HA) и, наконец, собственно метод секвенирования

Основные характеристики этих методов приведены в Табл.4.3

Таблица 4.3. Преимущества и недостатки основных методов пер-

вичной идентификации мутаций.

-------T---------T--------T------------T----------------¬

¦метод ¦ размер ¦ %% ¦ точность ¦ сканирование ¦

¦ ¦фрагмента¦детекции¦картирования+---------T------+

¦ ¦ (п.о.) ¦мутаций ¦ мутации ¦ экзонов ¦ кДНК ¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

+------+---------+--------+------------+---------+------+

¦SSCP ¦ 250 ¦ 80% ¦ нет ¦ +++ ¦ + ¦

¦DGGE ¦ 600 ¦ 95% ¦ нет ¦ ++ ¦ ++ ¦

¦СМС ¦ 1700 ¦>95% ¦ да ¦ + ¦ +++ ¦

¦PCR DS¦ 500 ¦>99% ¦ да ¦ ++ ¦ ++ ¦

¦НА ¦ 300 ¦ 80% ¦ нет ¦ ++ ¦ + ¦

L------+---------+--------+------------+---------+-------

"+" - применимость метода для сканирования геномной ДНК и

кДНК

SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) - метод

анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК, пред-

ложенный (Оrita et al.1989, Сlavac, Dean, 1993) основан на

регистрации различий в электрофоретической подвижности одно-

нитевых ДНК, одинаковых по величине, но различающихся

вследствие нуклеотидных замен по пространственной организа-

ции молекул (Рис 4.4). Скручивание или конформация небольших

однонитевых ДНК существенно зависит от их нуклеотидной

последовательности, так что замена даже одного основания в

молекулах одинакового размера приводит к изменению их прост-

ранственной структуры. Метод включает амплификацию специфи-

ческих сегментов ДНК размером от 50 до 300 пар оснований,

обычно в присутствии меченых трифосфатов, денатурацию обра-

зовавшихся продуктов ПЦР и нативный высокоразрешающий элек-

рофорез в полиакриламидном геле. Иногда амплификацию прово-

дят без использования метки, но тогда для лучшего разделения

ДНК и однозначной идентификации бэндов на электрофореграмме

используют специальные гели - Hydrolink либо MDE (AT

Biochem,USA), а также более чувствительные по сравнению с

этидиумом бромидом методы окрашивания, такие как окраска се-

ребром. На процесс конформации оказывают влияние различные

внешние факторы - температура, концентрация акриламида и

глицерина в геле, ионная сила буферных растворов

(Сlavac,Dean,1993). Оптимальный подбор этих параметров поз-

воляет эффективно разделять амплифицированные фрагменты ДНК,

различающиеся даже всего на один нуклеотид. Конформационный

метод выявления точечных мутаций быстро получил широкое

распространение благодаря своей простоте и возможности обна-

руживать любые типы замен. Эффективность детекции мутаций

при размерах амплифицируемого фрагмента менее 200 п.о.

составляет 70-95%, но при длине фрагмента, превышающей 400

п.о., вероятность обнаружения мутаций уменьшается до 50%.

DGGE (Denaturation Gradient Gel Electrophoresis) - ме-

тод денатурирующего градиентного гель-электрофореза, основан

на зависимости свойств плавления (или денатурации) небольших

двухнитевых молекул ДНК от их нуклеотидной последователь-

ности, а точнее от соотношения A-T и G-C пар в исследуемых

фрагментах (Майерс и др.,1990; Fodde, Losekoot, 1994). Объ-

ясняется это тем, что G-C связь более прочная по сравнению

со связью между нуклеотидами A и T. Подобные различия в ди-

намике плавления могут быть выявлены путем сравнения подвиж-

ности нормальных и мутантных двухнитевых фрагментов ДНК при

их электрофорезе в денатурирующих условиях ( Рис.4.5). Гра-

диент денатурации достигается разницей температур, различной

концентрации мочевины или формальдегида в гелях. При этих

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14