: Литература - Другое (книга по генетике)

: Литература - Другое (книга по генетике)

транспозоноподобных повторяющихся последовательностей.

Удельный вес мобильных (транспозонподобных) элементов типа

Alu и Line повторов (см. Главу 2) в возникновении генных му-

таций до конца не выяснен. Имеются единичные наблюдения о

реальном перемещнии этих элементов по типу конверсии и их

интеграции в структурные гены аденозиндезаминазы, аполипоп-

ротеина С, факторов VIII и IX свертывания крови, кальмодули-

на (Vidaud et al.,1993).

Раздел 5.4 Механизмы поддержания и распространения му-

таций в популяциях.

Частоты и характер распределения мутаций в популяциях

зависят от многих факторов, главными из которых являются

частоты мутагенеза и давление естественного отбора. Значи-

тельное влияние на этот процесс оказывают также структурные

особенности популяций, такие как размеры, степень географи-

ческой и этнической изолированности, величина инбридинга,

характер миграции населения.

Для всех мутаций, возникающих за счет повышенного уров-

ня спонтанного мутагенеза, характерны следующие особенности

- неслучайный характер внутригенной локализации мутаций,

сходство типов нарушений при отсутствии полной молекулярной

идентичности между ними. В отличие от спонтанных мутаций,

вызыванных эндогенными причинами, для мутаций, индуцирован-

ных действием неблагоприятных факторов внешней среды, про-

мышленными и сельскохозяйственными вредностями, ионизирующим

облучением, химическими агентами и прочим, специфики в типах

мутаций и в характере их локализации не наблюдается. В попу-

ляциях, находящихся в области действия таких неблагоприятных

факторов, будет повышена частота мутаций в различных генах,

однако спектр индуцированных мутаций будет достаточно разно-

образным.

Рассмотрим теперь влияние отбора на процесс поддержа-

ния и распространения мутаций в популяциях. Многие гены мо-

ногенных наследственных заболеваний рецессивны, то есть му-

тации в них в гетерозиготном состоянии не оказывают вредного

влияния на жизнеспособность. Поэтому после возникновения му-

тация может распространяться в популяции до определенной

концентрации, практически не подвергаясь элиминирующему

действию естественного отбора. В дальнейшем частота этой му-

тации достигнет равновесного состояния и не будет повышаться

за счет выщепления гомозиготных особей, жизнеспособность и

репродуктивные качества которых резко снижены. При этом ско-

рость элиминации мутации из популяции резко замедляется при

снижении ее частоты и, практически, после возникновения му-

тация может сохраняться в популяции на протяжении многих

десятков и даже сотен поколений. Различные мутации могут

случайным образом получить большее распространение в изоли-

рованных популяциях или среди групп населения, отличающихся

повышенным уровнем инбридинга. В целом, при отсутствии дав-

ления отбора по отношению к гетерозиготным особям общая кон-

центрация мутантных аллелей в популяции определяется часто-

той их спонтанного возникновения, при этом пул мутаций будет

состоять из большого количества разнообразных аллелей, каж-

дый из которых будет представлен редкими или даже единичными

случаями в различных популяциях.

Однако, специфические мутации могут получить значи-

тельно более широкое распространение в тех случаях, когда

гетерозиготные особи имеют какие-либо селективные преиму-

щества. Таким эффектом может обладать сама мутация, но более

вероятна возможность неравновесности по сцеплению между этой

мутацией и селективными аллелями другого локуса. Гетерозиго-

ты могут получить преимущество при изменении условий окружа-

ющей среды, в каких -то экстремальных ситуациях или среди

определенных групп населения. Так например, мутации, повыша-

ющие устойчивость организма к действию инфекционных агентов,

могут получить широкое распространение в период массовых

эпидемий. Одновременно повысится частота всех аллелей других

локусов, находящихся в неравновесности по сцеплению с данной

мутацией. Мутантные аллели, обеспечивающие селективное преи-

мущество гетерозигот, становятся преобладающими во многих

популяциях, не полностью изолированных друг от друга. При

этом наибольшая частота таких аллелей будет наблюдатся в ра-

йонах, где влияние поддерживающего отбора было максимальным

(например, в эпицентре эпидемии). По мере удаления от этого

района концентрация таких мутантных аллелей будет умень-

шаться, причем их распределение в разных популяциях будет

коррелировать с характером миграции населения. Подобный ха-

рактер распределения определенного мутантного аллеля в

частично изолированных популяциях принято связывать с так

называемым эффектом основателя или родоначальника.

Исследование спектров распределения мутаций в различ-

ных популяциях позволяет делать предположения относительно

возможного происхождения таких повреждений и тех механизмов,

которые лежат в основе их распространения среди населения.

Рассмотрим наиболее вероятные интерпретации различных

вариантов распределения аллелей в популяциях. Мутации,

представленные у единичных больных или в группе родственных

индивидуумов и не имеющие специфической внутригенной локали-

зации, по-видимому, являются следствием естественного мута-

ционного процесса. Если в каких-то популяциях концентрация

мутаций в различных генах повышена, вероятно, они находятся

в зоне действия внешних неблагоприятных факторов, индуцирую-

щих возникновение нарушений в структуре ДНК. В тех случаях,

когда локализация и типы мутаций носят специфический харак-

тер можно предполагать наличие особых молекулярных механиз-

мов контроля повышенного уровня мутагенеза в определеннных

районах генома. Распространение специфических мутаций в изо-

лированных популяциях происходит за счет их ограниченного

размера и повышенного уровня инбридинга (эффект родоначаль-

ника). И, наконец, обнаружение градиентного распределения

мутаций, превалирующих в различных, частично изолированных

популяциях позволяет предполагать селективное преимущество

гетерозиготных носителей мутаций на определенных этапах эво-

люционного развития.

Таким образом, сопоставляя спектры распределения одно-

типных мутаций у жителей разных континентов, разных стран, у

людей, принадлежащих к различным расам и национальностям

можно определить степень генетической близости между всеми

этими группами и реконструировать их филогенетические отно-

шения (Cavalli-Sforza,Piazza,1993). Одним из практических

следствий этих исследований является возможность прогнозиро-

вать наиболее вероятные мутации в различных генах у пациен-

тов разного этнического происхождения, что приводит к суже-

нию спектра поиска специфических мутаций. Особый интерес в

этом смысле представляют наиболее распространенные мутации

(например delF508 при муковисцидозе; R408W - при фенилкето-

нурии и многие другие). Для профилактики наследственных за-

болеваний необходима разработка эффективных и простых мето-

дов молекулярной диагностики таких мутаций как у больных,

так и у гетерозиготных носителей с целью проведения скрини-

рующих программ среди населения и выявления максимально воз-

можного числа семей с повышенным риском рождения больного

ребенка.

ГЛАВА VII.

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРЕНАТАЛЬНОЙ ДИАГ-

НОСТИКИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ.

Раздел 7.1 Прямые и косвенные методы молекулярной диаг-

ностики.

Локализация и клонирование кДНК-овых последовательнос-

тей генов открывают принципиально новые возможности диагнос-

тики наследственных заболеваний, основанные на исследовании

мутантных аллелей у пациентов, членов их семей или у предпо-

лагаемых гетерозиготных носителей патологических мутаций.

Это в равной мере относится и к пренатальной диагностике,

которая может быть проведена с использованием молекулярных

методов анализа на самых ранних стадиях развития плода

(см.7.5). Эти же подходы вполне приемлемы для диагностики до

появления каких-либо клинических или биохимических симптомов

болезни (досимптоматическая диагностика), что позволяет вы-

работать и начать рациональную тактику лечения (упреждающая

терапия), а также эффективно выявлять гетерозиготных носите-

лей в семьях высокого риска, что является важным фактором

профилактики наследственных болезней. Решающими преимущест-

вами молекулярной диагностики являются её универсальность,

возможность использовать для анализа любые ДН-содержащие

клетки или ткани, причем анализ может быть произведен на лю-

бых стадиях онтогенеза, начиная со стадии зиготы.

Принципиально различают прямую и непрямую ДНК-диагнос-

тику мононогенных наследственных болезней. В общем случае,

использование прямых методов диагностики возможно лишь для

клонированных генов с известной нуклеотидной последователь-

ностью полноразмерной кДНК, при этом необходимо предвари-

тельное генотипирование мутантных аллелей у родителей. В

случае прямой диагностики обьектом молекулярного анализа яв-

ляется сам ген, точнее мутации этого гена, идентификация ко-

торых и составляет основную задачу исследования. Такой под-

ход особенно эффективен при наличии точной информации о при-

роде, частоте и локализации наиболее распространенных (доми-

нирующих по частоте) мутаций соответствующих генов, а также

о наличии в них особенно легко мутирующих "горячих" точек. К

таковым относятся мутация delF508 и ряд других мутаций при

муковисцидозе, делеционные мутации при миодистрофии Дюшенна,

мутация R408W при фенилкетонурии, инверсионная мутация при

гемофилии А, протяженная делеция при адрено-генитальном

синдроме, экспансии триплетных повторов в случае "динамичес-

ких" мутаций при синдроме ломкой X-хромосомы и при ряде дру-

гих нейродегенеративных заболеваний (см. Главы IV и X). Ме-

тоды, используемые для направленного поиска этих мутаций,

подробно рассмотрены в Главе IV. В ряде случаев (муковисци-

доз, фенилкетонурия, серповидно-клеточная анемия) эти методы

удалось автоматизировать, что позволяет одноверменно тести-

ровать сразу несколько (до 30 и более) различных мутаций.

При этом появляется реальная возможность выявлять свыше

95-98% мутантных хромосом, что делает целесообразным и эко-

номически оправданным скринирование всей популяции отдельных

стран на выявление мутантных особей для последующей органи-

зации эффективных профилактических мероприятий, направленных

на предупреждение рождения больных детей. Подобные программы

по муковисцидозу уже успешно проводятся в ряде стран Запад-

ной Европы (Великобритания, Дания, Франция) и Северной Аме-

рики.

Главное преимущество прямого метода - это высокая, до-

ходящая до 100%, точность диагностики и отсутствие необходи-

мости анализа всей семьи на предмет её информативности

(см.ниже). Последнее обстоятельство особенно важно для про-

ведения пренатальной диагностики тяжелых, зачастую летальных

наследственных болезней (муковисцидоз, миодистрофия Дюшен-

на, гемофилия А и др). Такие семьи нередко обращаются за ме-

дико-генетической помощью уже после того как больной ребенок

умер. Так, по нашим наблюдениям до 80% семей с высоким рис-

ком муковисцидоза обращаются по поводу необходимости дородо-

вой диагностики уже после смерти больного ребенка (Baranov

et al., 1992).

Однако, существует огромное количество наследственных

болезней, для которых мутации не описаны либо не найдено ма-

жорных мутаций в исследуемых популяциях. И даже во всех тех

случаях, когда имеются мажорные мутации, наряду с ними, опи-

саны многочисленные редко встречающиеся (вплоть до единичных

случаев), так называемые минорные мутации. Кроме того, всег-

да сохраняется возможность присутствия у пробанда неизвест-

ных мутаций, а клонирование гена больного человека для целей

прямого секвенирования, даже ограниченного только смысловой

его частью - кДНК, далеко не всегда возможно в силу очевид-

ных финансовых и временных ограничений такого подхода. Эти

трудности успешно преодолеваются благодаря наличию непрямых

(косвенных) методов молекулярной диагностики.

Этот исторически более ранний подход основан на исполь-

зовании сцепленных с геном полиморфных маркеров, с помощью

которых проводится идентификации мутантных хромосом (точнее

хромосом, несущих мутантный ген) в семьях высокого риска, то

есть у родителей больного и его ближайших родственников. В

настоящее время косвенные методы молекулярной диагностики

принципиально возможны практически для всех моногенных забо-

леваний с известной локализацией контролирующего гена, для

каждого из которых уже разработана удобная система вне- и

внутригенных полиморфных индексных маркеров (см.Главу III).

Более того, косвенные методы молекулярной диагностики

пригодны даже для тех болезней, гены которых еще не иденти-

фицированы и мутации не известны. Единственным и непременным

условием этого является наличие полиморфных сайтов рестрик-

ции либо коротких тандемных повторов типа STR, находящихся в

непосредственной близости от мутантного гена или, что еще

лучше, внутри него (чаще всего в интронах). При помощи этих

полморфных сайтов удается маркировать мутантные аллели гена

и проследить их передачу потомству (см. Главу 111). Ранние

иследования непрямым методом проводились почти исключительно

с использованием полиморфных сайтов рестрикции - двухаллель-

ной системы, информативная емкость которой не превышает 50%,

а реальное число гетерозигот по данному признаку в популя-

ции, зачастую, оказывается существенно ниже 0.5. Следова-

тельно, в лучшем случае только половина гетерозиготных носи-

телей наследственного заболевания, вызванного рецессивной

мутацией какого-нибудь гена, может быть доступна непрямой

молекулярной диагностике с использованием одного полиморфно-

го сайта рестрикции. Повышение информативности в случае

ПДРФ-анализа могло быть достигнуто только путем увеличения

числа полиморфных сайтов. Как првило, для диагностики необ-

ходим не один, а 3-4 полиморфных сайта, что далеко не во

всех случаях возможно. Многие из полиморфных сайтов локали-

зованы вне генов на расстояниях, при которых кроссинговер

может в заметном проценте случаев исказить результаты диаг-

ностики. Кроме того, практическое использование рестрикцион-

ных сайтов зачастую затруднено из-за отсутствия или большой

стоимостью соответствующих эндонуклеазных рестриктаз.

Все эти недостатки могут быть устранены при использова-

нии в качестве молекулярных маркеров высокополиморфных тан-

демно повторяющихся коротких три- и тетрамерных повторов

(STR) (см. Главу III). Для многих генов найдены уникальные

паттерны полиморфных аллелей, отличающихся по числу "коро-

вых" едининц повторяющихся последовательностей нуклеотидов.

Такие "количественные" полиморфизмы , как уже упоминалось

(см.Главу III), очень широко распространены по всему геному

и присутствуют в интронных и фланкирующих областях многих

генов. Появление в конце 1994г 0.7-сантиморганной карты ге-

нома человека, построенной на базе высокополиморфных динук-

леотидных (C-A)n повторов, сделало реальным маркирование,

практически, любого картированного гена. Особенную диагнос-

тическую ценность представляют внутригенные маркеры, для ко-

торых резко снижена вероятность кроссинговера с мутантными

аллелями гена, а следовательно, особенно высока точность ди-

агностики. Кроме того, как оказалось, многие внутригенные

полиморфные короткие тандемные повторы обнаруживают сильное

неравновесие по сцеплению с определенными мутантными аллеля-

ми гена, что значительно облегчает их идентификацию в отяго-

щенных семьях. Индекс гетерозиготности таких полиаллельных

мини- и микросателитных систем нередко превышает 0.8. Их

применение позволяет маркировать, то есть сделать информа-

тивными (см. 7.4) для ДНК-диагностики практически все семьи

высокого риска при условии наличия больного ребенка или дос-

тупности для молекулярного анализа его патанатомического ма-

териала .

Изучение полиморфных маркеров у больного пробанда и его

родителей и выяснение аллельной природы молекулярного марке-

ра, так называемое "определение фазы сцепления" (см.раздел

7.4), составляет основу для дальнейшей диагностики косвенны-

ми методами (Евграфов, Макаров,1987). Применение косвенных

методов молекулярной диагностики предусматривает также в ка-

честве обязательного предварительного этапа исследование

частоты аллелей соответствующих полиморфных сайтов в анали-

зируемых популяциях, среди больных и гетерозиготных носите-

лей мутаций, а также определение вероятности рекомбинации и

неравновесности по сцеплению между маркерными сайтами и му-

тантными аллелями гена. Такие исследования проводятся с по-

мощью методов блот-гибридизации по Саузерну, либо ПЦР

(см.разделы 1.3.; 1.7; 2,5). В первом случае в распоряжении

исследователя должны быть соответствующие ДНК-зонды, во вто-

ром - должны быть известны нуклеотидные последовательности

районов ДНК, включающие соответствующие полиморфные сайты,

для выбора олигопраймеров (см. Главы II,1V).

Раздел 7.2. ДНК-диагностика при различных типах насле-

дования.

Напомним, что значительное число моногенных заболеваний

наследуется по рецессивному типу. Это значит, что при ауто-

сомной локализации соответствующего гена болеют только гомо-

зиготные носители мутаций. Гетерозиготы клинически здоровы,

но с равной вероятностью передают своим детям мутантный или

нормальный варианты гена. Таким образом, на протяжении дли-

тельного времени мутация в скрытом виде может передаваться

из поколения в поколение. При аутосомно-рецессивном типе

наследования в родословных тяжелых больных, которые либо не

доживают до репродуктивного возраста, либо имеют резко сни-

женные потенции к размножению, редко удается выявить больных

родственников, особенно, по восходящей линии. Исключение

составляют семьи с повышенным уровнем инбридинга, который

возникает либо за счет высокой частоты близкородственных

браков, либо за счет вступления в брак людей из одинаковых

изолированных популяций ограниченной численности. Больные

дети с вероятностью 25 % рождаются в тех семьях, где оба ро-

дителя являются гетерозиготными носителями мутаций одного и

того же гена. Возможно также рождение больного ребенка в та-

кой семье, где только один из супругов несет мутацию, а вто-

рая мутация возникла в гамете его партнера в момент, пред-

шествующий оплодотворению. Доля таких семей в общей группе

риска относительно невелика, а риск повторного рождения в

них больного ребенка не превышает общей частоты спонтанного

возникновения мутаций в данном гене. Для болезней, сцеплен-

ных с полом, то есть контролируемых генами, локализоваными в

Х-хромосоме, характерно то, что болеют преимущественно маль-

чики, тогда как носителями являются девочки.

Y-хромосома содержит очень мало генов, большинство из

которых (около 10) картировано в так называемой псевдоауто-

сомной области короткого плеча, гомологичной таковой на ко-

ротком плече X-хромосомы. Важнейшим истинным геном Y-хромо-

сомы, то есть геном, представленным только на этой хромосо-

ме, является ген SRY (Yp21.1), детерминирующий развитие пола

по мужскому типу. Мутации этого регуляторного гена приводят

к нарушениям половой дифференцировки (XY-женщины), а его пе-

ренос вследствие ошибок рекомбинации псевдоаутосомных райо-

нов на короткое плечо X-хромосомы обусловливает синдром ре-

версии пола- Sex reverse (XX-мужчины) (McElreavey et al.,

1993). Практически важно, что присутствие даже небольшого

околоцентромерного фрагмента длинного плеча Y-хромосомы при

кариотипе XX является безусловным показанием для удаления

зачатков гонад у таких индивидуумов в связи с высокой веро-

ятностью экспрессии гена Gba, ведущего к их злокачественному

перерождению - гонадобластоме (Giquel et al., 1992). В отли-

чие от Y-хромосомы, большая по размеру X-хромосома человека

несет до 5% всех структурных генов, многие из которых уже

идентифицированы (см. Главу III).

Все рецессивные аллели Х-хромосомы у мальчиков проявляют-

ся, так как находятся в гемизиготном состоянии. Девочки мо-

гут болеть в том случае, если они гомозиготны по мутации.

Такая возможность может осуществиться в семье, где болен их

отец, а мать является носительницей мутации и передала доче-

ри свой мутантный аллель. Если отец больной девочки здоров,

можно предполагать, что мутация возникла в той его гамете,

которая участвовала в оплодотворении. Х-сцепленные заболева-

ния у девочек (миодистрофия Дюшенна, гемофилия А) могут быть

следствием сочетанного проявления мутации этих генов у одно-

го из родителей и делеции соответствующих фрагментов хромо-

сом у другого. В этих редких случаях у девочек, как и у

мальчиков, мутации Х-сцепленных генов будут находиться в ге-

мизиготном состоянии

При доминантном наследовании для развития болезни дос-

таточно одного мутантного аллеля. Такие больные с вероят-

ностью 50% рождаются в семьях, где один из родителей болен.

Очень редко больные дети с доминантным типом наследования

могут родиться и у здоровых родителей в результате мутирова-

ния одной из гамет. Однако, вероятность повторного рождения

больного ребенка в такой семье такая же, как и для популяции

в целом. Пренатальная диагностика доминантных болезней про-

водится достаточно редко по ряду причин. Во-первых, такие

болезни составляют относительно небольшой процент среди всех

моногенных заболеваний. Во-вторых, тяжелые болезни, сопро-

вождающиеся летальным исходом в раннем возрасте или приводя-

щие к бесплодию, не передаются по наследству, а появляются

каждый раз заново вследствие мутации при созревании гамет.

Необходимость же предотвращения рождения больных, которые не

только доживают до репродуктивного возраста, но и способны

оставить потомство, является вопросом дискуссионным. Прове-

дение пренатальной диагностики таких заболеваний принимается

с учетом многих конкретных обстоятельств. Актуальность этой

проблемы стала особенно очевидной в последние годы, когда

была открыта многочисленная группа доминантных нейродегене-

ративных заболеваний (см. Главу IV), которые проявляются

сравнительно поздно, нередко уже в репродуктивном возрасте,

тяжело протекают и, по-сути, не имеют сколько-нибудь реаль-

ной терапии. Для таких заболеваний первостепенное значение

приобретают методы досимптоматической диагностики с исполь-

зованием методов ДНК-анализа (см.Главу X).

Значительно больше распространены моногенные болезни с

частичным доминированием и неполной пенетрантностью. Для по-

добных заболеваний риск рождения больного ребенка в отяго-

щенной семье зависит от конкретных значений этих параметров,

которые, в свою очередь, определяются молекулярными механиз-

мами, лежащими в основе формирования такого рода отклонений

от Менделевского типа наследования.

Разработка молекулярных методов диагностики болезней,

вызванных мутациями в митохондриальных генах, как показывают

исследования последних лет (McKusick, 1994), приобретает

особое значение. Как правило, в основе различных митохондри-

альных болезней лежат нарушения в системе окислительного

фосфорилирования. Поскольку некоторые ткани обладают повы-

шенной чувствительностью к подобным нарушениям, сходная кли-

ническая картина заболеваний может наблюдаться вследствие

мутаций разных митохондриальных генов. Наследование таких

болезней значительно отличается от Менделевского типа, в

превую очередь, из-за материнского характера наследований

митохондрий, наличия в зиготе и соответственно во всех клет-

ках организма большого числа копий митохондриальных хромо-

сом, из-за особенностей сегрегации этих хромосом при делении

клеток и, наконец, из-за тех количественных и качественных

изменений в митохондриальной ДНК, которые соровождают про-

цессы онтогенетической дифференцировки клеток и старения ор-

ганизма.

Для всех "митохондриальных болезней" характерен мате-

ринский тип наследования и присутствие мутантных аллелей

только в части хромосом (так называемая гетероплазмия), доля

которых может варьировать в разных тканях. Как правило, су-

ществует определенное пороговое значение доли мутантных хро-

мосом, превышение которого ведет к появлению и прогрессиро-

ванию заболевания. Сокращение числа митохондрий, происходя-

щее в норме при старении, может способствовать увеличению

доли мутантных хромосом в определнных тканях и тем самым

быть причиной болезни. Неслучайно поэтому, что для многих

"митохондриальных болезней", характерно позднее начало. В

силу функциональных особенностей митохондриальных генов час-

то наблюдается кумулятивный эффект двух и более мутаций, ло-

кализованных в разных генах. Важным представляется также то

обстоятельство, что в митохондриальных генах OXPHOS-комплек-

са частота возникновения мутаций выше, чем в ядерных генах,

кодирующих субьединицы окислительного фосфорилирования

(McKusick, 1994).

Раздел 7.3. Группы риска, поиск гетерозиготных носите-

лей мутаций.

Как следует из вышеизложенного, точная диагностика в

сочетании с детальным анализом типа наследования того или

иного заболевания имеет определяющее значение для формирова-

ния групп риска, то есть отбора семей, в которых вероятность

рождения больных детей повышена. Прежде всего, это те семьи,

где уже есть или был ребенок, страдающий каким-либо моноген-

ным наследственным заболеванием. Для аутосомно-рецессивных

болезней с большой долей вероятности можно считать, что оба

родителя этого ребенка являются гетерозиготными носителями

мутантных аллелей соответствующего гена и риск повторного

рождения больного ребенка в такой семье составляет 25%, не-

зависимо от исхода предыдущих родов. Поэтому в таких случаях

рекомендуется обязательная пренатальная диагностика плода

при каждой последующей беременности.

Для сцепленных с полом заболеваний важной практической

задачей является выявление случаев спонтанного возникновения

мутаций в родительском поколении. Для таких распространенных

заболеваний, как миодистрофия Дюшенна и гемофилия А, почти

1/3 всех случаев имеет спонтанное происхождение. При этом

мутации гена дистрофина, как правило, возникают в оогенезе,

то есть у матери, а мутации гена фактора Y111, обычно, появ-

ляются во время сперматогенеза у деда больного ребенка (см.

Главу X). В отличие от тех семей, в которых мать гетерози-

готна, вероятность повторного рождения больного ребенка в

семьях со спонтанной мутацией не превышает среднепопуляцион-

ной частоты, и потому нет необходимости проводить пренаталь-

ную диагностику плода при последующих беременностях. Специ-

ального рассмотрения в этой связи заслуживает,однако, вопрос

гонадного мозаицизма, то есть наличия в гонадах матери гене-

тически нормальных и мутантных ооцитов. Особенно велик риск

такого состояния в случае миодистрофии Дюшенна. Гонадный мо-

зацизм в силу своей органной специфики достаточно трудно до-

казать или опровергнуть. Между тем, считается что 6,7% спо-

радических случаев иодистрофии Дюшенна обусловлена гонадным

мозаицизмом у матери (Essen et al.,1992).

Подробное медико-генетическое консультирование семей, в

которых зарегистрированы спонтанные случаи рождения детей с

Х-сцепленными заболеваниями в сочетании с соответствующими

лабораторными, в том числе и молекулярными исследованиями,

как правило, позволяют ответить на вопрос о происхождении

мутации. Так,гетерозиготное носительство у матери может быть

заподозрено, в частности, по содержанию соответствующих бел-

ковых продуктов (например, фактора Y111 свертывания крови

при гемофилии А; дистрофина в мышцах и креатинкиназы в сыво-

ротке крови при миодистрофии Дюшенна) либо при помощи специ-

альных ДНК-методов, позволяющих идентифицировать мутантный

аллель у матери. Если дифференцировка этих случаев невозмож-

на или доказано, что мутация у больного ребенка не является

спонтанной, следует предпологать, что мать является гетеро-

зиготной носительницей и с 50%-ой вероятностью будет переда-

вать болезнь своим сыновьям. В этом случае пренатальная ди-

агностика обязательна и должна сопровождаться определением

пола плода. Следует, однако, подчеркнуть, что установление

мужского пола плода на сегодняшний день отнюдь не является

показанием для прерывания беременности, поскольку в 50% слу-

чаев они получают от матери X-хромосому с нормальным аллелем

гена и являются вполне здоровыми. Определить, какую именно X

-хромосому (с нормальным или мутантным аллелем) получил бу-

дущий мальчик, и является задачей молекулярной диагностики.

С помощью прямых и непрямых методов ДНК-диагностики эта за-

дача уже практически решается для очень многих сцепленных с

полом заболеваний (см.Главу X).

Наиболее эффективной мерой профилактики наследственных

заболеваний является выявление гетерозиготных носителей му-

таций, так как при этом удается предотвратить рождение пер-

вого больного ребенка в семьях высокого риска. Родственники

больного с большой вероятностью могут быть гетерозиготными

носителями мутантных аллелей, поэтому в тех случаях, когда

это возможно, они подлежат обследованию в первую очередь.

Для болезней, сцепленных с полом, это родственники по женс-

кой линии - сестры, дочери и тетки пробанда. Их диагностика

особенно важна, так как вероятность рождения больных сыновей

в потомстве носительниц мутаций очень высока и не зависит от

генотипа супруга. При аутосомно-рецессивных заболеваниях по-

ловина сибсов родителей и 2/3 здоровых сибсов больного будут

гетерозиготными носителями мутации. Поэтому в тех семьях,

где принципиально возможна молекулярная идентификация му-

тантных аллелей, необходимо обследовать максимальное число

родственников больного пробанда для выявления гетерозиготных

носителей. Иногда в больших семьях с разветвленными родос-

ловными удается проследить наследование неидентифицируемых

мутаций с помощью косвенных методов молекулярной диагности-

ки.

Для заболеваний, распространенных в определенных попу-

ляциях или в каких-то этнических группах и обусловленных

присутствием одного или нескольких преобладающих и легко

идентифицируемых мутантных аллелей, возможно проведение то-

тального скрининга на гетерозиготное носительство этих мута-

ций среди определенных групп населения, например, среди бе-

ременных женщин или среди новорожденных. Считается, что по-

добный скрининг экономически оправдан в том случае, если при

проведении процедуры выявляются аллели, составляющие не ме-

нее 90 - 95 % всех мутаций данного гена в исследуемой попу-

ляции. Выявленные при подобных обследованиях носители мута-

ций также составляют группу риска, и в последующем должны

быть аналогичным образом протестированы их супруги. Однако,

даже в том случае, если мутация найдена только у одного из

родителей, вероятность рождения больного ребенка несколько

выше популяционной частоты, но, конечно, значительно меньше

25%. Конкретное значение этого риска зависит от общей часто-

ты мутаций соответствующего гена в популяции. В таких семьях

по желанию родителей также может быть проведена пренатальная

диагностика и прослежено наследование мутантного аллеля. При

отсутствии этой мутации у плода прогноз считается благопри-

ятным, независимо от того, какие аллели ребенок получит от

второго супруга.

Раздел 7.4 Особенности применения молекулярных методов

в пренатальной диагностике моногенных болез-

ней.

Следующим шагом после отбора нуждающейся в пренатальной

диагностике семьи является комплексное молекулярное обследо-

вание ее членов - родителей и, если есть такая возможность,

больного ребенка. Эти исследования могут быть достаточно

длительными и поэтому желательно их проводить до наступления

беременности. Результаты молекулярного обследования семьи

служат основой для назначения и выбора способов проведения

пренатальной диагностики. После этого семья планирует бере-

менность, и в определенные сроки женщина поступает в клинику

для проводения процедуры, обеспечивающей забор необходимых

для диагностики тканей плодного происхождения. При этом сле-

дует учитывать, что определение конкретных сроков этой про-

цедуры зависит от многих медицинских показаний (в превую

очередь, акушерских), обеспечивающих максимальную безопас-

ность подобного инвазивного вмешательства как для матери,

так и для будущего ребенка (Баранов и др.,1994; Бара-

нов,1994).

Наиболее объективная информация о наличии моногенного

наследственного заболевания у плода может быть получена при

анализе его ДНК и обнаружении мутационных изменений в коди-

рующих или регуляторных последовательностях соответствующих

генов. Практическая диагностика мутантных аллелей в семьях

высокого риска проводится для заболеваний с известным спект-

ром наиболее часто встречающихся мутаций. При этом для каж-

дой болезни разрабатываются относительно простые и наиболее

эффективные методы идентификации мутантных аллелей. В насто-

ящее время насчитывается уже несколько сотен таких заболева-

ний и количество их быстро увеличивается (Baranov,1993; Ба-

ранов,1994; см.Главу X).

Для генотипирования мутаций, то есть для выяснения при-

роды мутантных аллелей у больного и его родителей использу-

ются различные стандартные методы, подробно изложенные в

главе IV. Выбор конкретного метода зависит от типа предпола-

гаемых мутаций и от методических возможностей диагностичес-

ких центров. При отсутствии у пробанда наиболее частых и ра-

нее описанных мутаций его ДНК может быть направлена в специ-

ализированные молекулярно- генетические лаборатории для бо-

лее тщательного анализа с использованием всего комплекса ме-

тодов идентификации мутаций вплоть до получения и секвениро-

вания мутантных кДНК- вых последовательностей гена. Однако,

подобные исследования очень дороги, требуют много труда и

времени и потому в обычной клинической практике используются

достаточно редко. В этих случаях чаще прибегают к косвенным

методам молекулярной диагностики (см. раздел 7.1). Для мно-

гих заболеваний, эти методы все еще остаются единственно

возможными (см.Главу X). Однако, как уже указывалось, они

требуют обязательного обследования полной семьи, включая

больного ребенка. При его отсутствии молекулярное маркирова-

ние мутантных генов у гетерозиготных родителей становится

невозможным, а, следовательно, невозможна и пренатальная ди-

агностика.

Идентификацию мутантных генов осуществляют путем срав-

нения маркерных генотипов родителей и больного ребенка. Если

не произошел кроссинговер между маркерным локусом и геном,

все больные дети в семье должны иметь одинаковый маркерный

генотип. Поэтому при проведении пренатальной диагностики

сходство генотипов плода и пробанда является необходимым,

однако в ряде случаев, вовсе не достаточным условием для

подтверждения наличия заболевания. Так, например, у гомози-

готных по маркеру родителей все дети будут иметь одинаковый

генотип по этому локусу независимо от присутствия мутантных

аллелей гена. Необходимым условием дифференцировки нормаль-

ных и мутантных генов у носителей мутаций является их сцеп-

ление с разными аллелями маркерного локуса. Поэтому, дискри-

минация мутантных генов у родителей возможна только с по-

мощью гетерозиготных маркеров. При этих условиях мутантные

гены родителей могут быть определены по тем маркерным алле-

лям, которые присутствуют у больного ребенка. Однако, иден-

тификация по маркерным аллелям обоих мутантных генов возмож-

на лишь в тех случаях, когда родители гетерозиготны, а про-

банд (больной) гомозиготен по маркерному локусу.

Возможность идентификации мутантных генов родителей на

основе анализа маркерных генотипов определяет информатив-

ность семьи по отношению к данному маркеру. На Рис.7.1

представлены возможные маркерные генотипы в полностью и час-

тично информативных, а также в неинформативных семьях при

определении их путем блот-гибридизации с ДНК-зондом. Анало-

гичные схемы могут быть составлены и в тех случаях, когда

маркерные генотипы определяются путем анализа содержащих по-

лиморфные локусы амплифицированных фрагментов ДНК. В инфор-

мативных семьях маркерный генотип больного ребенка отличает-

ся от маркерных генотипов обоих родителей и здорового сибса,

поэтому можно проследить наследование мутантных генов при

каждой беременности. В этом случае сходство маркерных гено-

типов пробанда и плода достаточно для неблагоприятного прог-

ноза, а носители мутации будут иметь родительский генотип. В

частично информативных семьях идентифицируется только один

из мутантных генов, так как маркерный генотип больного ре-

бенка совпадает с генотипом одного или даже обоих родителей.

В этом случае при сходстве маркерных генотипов плода и про-

банда вероятность болезни будущего ребенка составляет 50%.

Все дети с другим маркерным генотипом будут здоровы, но по-

ловина из них будет нести один из мутантных аллелей. Неин-

формативный маркер не пригоден для идентификации мутантных

генов, а следовательно, и для проведения молекулярной диаг-

ностики в данной семье. При отсутствии полной информативнос-

ти необходимо исследовать другие сцепленные с геном поли-

морфные локусы и выбрать в качестве маркеров те из них, ко-

торые у родителей пробанда находятся в гетерозиготном состо-

янии. В частично информативных семьях можно проводить прена-

тальную диагностику с такой же степенью достоверности, как и

в полностью информативных семьях, при одновременном исполь-

зованием двух полиморфных локусов, каждый из которых марки-

рует разные мутантные гены обоих родителей. Информативными

оказываются также те семьи, в которых один из мутантных ал-

лелей может быть идентифицирован прямым анализом соответс-

твующего участка гена, а наличие другого мутантного аллеля

доказывается с помощью маркерного локуса. Для многих моно-

генных наследственных заболеваний количество идентифициро-

ванных высокополиморфных локусов, тесно сцепленных с контро-

лирующим геном, достаточно для того, чтобы более 90% семей

высокого риска оказались полностью информативными, а значит,

пригодными для проведения в них пренатальной диагностики с

использоваанием молекулярных методов тестирования состояния

плода.

Таким образом, при отсутствии возможности прямой иден-

тификации соответствующих мутантных аллелей, анализ информа-

тивности семьи следует начинать с наиболее полиморфных мар-

керных локусов. так как при этом больше вероятность того,

что родители больного ребенка окажутся гетерозиготами по

выбранному маркеру. При последующем выборе маркеров важно

также учитывать наличие между ними неравновесности по сцеп-

лению, так как чаще всего информативность семей в отношении

маркеров, находящихся в сильном неравновесии по сцеплению,

будет одинакова. Действительно, неслучайный характер цис- и

транс-расположения аллелей в неравновесных по сцеплению ло-

кусах обуславливает повышенную вероятность таких событий,

при которых гомозиготы по одному из маркеров оказываются го-

мозиготными и по другому. То же самое справедливо и в отно-

шении гетерозигот. Поэтому при анализе информативности

семьи, в первую очередь, следует выбирать маркерные локусы,

находящиеся между собой в равновесии по сцеплению.

Следует также учитывать, что определенные аллели поли-

морфных сайтов, расположенных близко к мутации, возникшей

однократно много лет назад и распросранившейся в популяции,

будут оставаться в очень тесном неравновесии по сцеплению.

Примером может служить неравновесность между delF508 (ориен-

тировочный возраст возникновения 30-50 000 лет) и 6-ти член-

ным тетрамерным повтором TAGG в интроне 6 гена муковисцидоза

(Chebab et al., 1993; Агбанглы и др., 1994). Поэтому в семь-

ях высокого риска с большой долей вероятности, конкретное

значение которой определяется детерминантом неравновесности

по сцеплению, гомозиготы по этому маркерному аллелю, окажут-

ся также гомозиготами и по мутации, то есть будут больны.

Конечно, пренатальный диагноз не может быть основан только

на этой информации, однако, её следует учитывать при выра-

ботке комплексного заключения относительно здоровья будущего

ребенка.

Во всех случаях при использовании косвенных методов мо-

лекулярной диагностики необходимо также помнить, что маркер-

ный генотип плода определяет наличие мутантных генов с точ-

ностью до вероятности кроссинговера между мутантным аллелем

и маркерным локусом. Поэтому, чем ближе расположен маркер по

отношению к мутантному аллелю, тем меньше вероятность ошибки

при проведении пренатальной диагностики. Для того чтобы пол-

ностью избежать или, по крайне мере, резко снизить вероят-

ность такой ошибки, желательно использовать внутригенные

маркеры или проводить одновременное тестирование ДНК плода с

помощью двух маркерных локусов, фланкирующих мутантный ал-

лель. Последний подход особенно оправдан при работе с очень

протяженными генами ( например геном дистрофина длиной около

2,2 миллионов пар оснований), где вероятность внутригенного

кроссинговера по некоторым данным может достигать 2-2,5%.

Раздел 7.5 Доимплантационная диагностика, точность прог-

нозирования.

Следует подчеркнуть, что общий подход к молекулярному

тестированию, практически, не зависит от формы нозологии,

так как для анализа генов и мутантных аллелей используется

один и те же методы (см. Глава IV). При наличии у больного

или у его родителей идентифицируемых мутаций или при нахож-

дении информативных для данной семьи ДНК-маркеров проведение

пренатальной диагностики становится возможным на любой ста-

дии развития и при любом сроке беременности.

ДНК-диагностика на начальных этапах развития человека,

безусловно, имеет свои методические особенности и тесно соп-

ряжена с приемами экстракорпорального оплодотворения и

трансплантации зародышей. Эти обстоятельства позволяют выде-

лить ее в самостоятельное научно-практическое направление -

доимплантационную диагностику генных и хромосомных болезней

(Verlinsky, Kuliev, 1993). Несмотря на очевидные успехи в

этой области, достигнутые в ряде зарубежных лабораторий (до-

имплантационная диагностика муковисцидоза, некоторых X-сцеп-

ленных заболеваний - миодистрофии Дюшенна, синдрома ломкой X

-хромосомы, гемофилии), данное направление исследований все

еще находится на уровне научных разработок и не имеет широ-

кого применения. Объектом ДНК-диагностики на этих стадиях

развития могут служить полярные тельца овулировавших яйцек-

леток и отдельные бластомеры зародыша, полученные методом

микрургии (Рис.7.2). Недостатком этого подхода является

сравнительно невысокий процент (до 30%) приживаемости опери-

рованных зародышей после их искусственной трансплантации в

матку. Подробно с методами доимплатационной диагностики, её

современным состоянием и перспективами можно ознакомиться в

уже цитированной монографии (Verlinsky, Kuliev, 1993). Есть

определенные основания считать, что в связи с быстрым ростом

числа центров экстракорпорального оплодотворения в Рос-

сии, заметным увеличением эффективности их работы, оценивае-

мой по числу наступивших беременностей и родов, методы доим-

плантационной диагностики наследственных болезней будут

привлкать к себе все большое число исследователей. Однако,

практическая значимость такого подхода в виду его высокой

стоимости и недостаточной надежности еще сравнительно долго

будет оставаться проблематичной, по крайней мере, в нашей

стране.

Обобщенный опыт различных молекулярных диагностических

центров мира свидетельствует о том, что оптимальным для пре-

натальной диагностики является первый триместр беременности

(10-12- недели), поскольку при неблагоприятном прогнозе бе-

ременность может быть прервана обычным медицинским абортом.

Зачастую молекулярную диагностику проводят и во втором три-

местре беременности (обычно на 17-21 неделях). Необходимые

для анализа образцы ДНК плода выделяют из биоптатов хориона

(плаценты), клеток амниотической жидкости (амниоцитов) или

из лимфоцитов пуповинной крови при помощи соответствующих

инвазивных процедур - хорионбиопсия, плацентобиопсия, амнио-

центез или кордоцентез, которые проводятся под контролем уль

тразвука (Рис. 7.3). Подробнее об этих методах, их преиму-

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14