: Литература - Другое (книга по генетике)

: Литература - Другое (книга по генетике)

ществах и недостатках можно узнать в соответствующих моног-

рафиях и обзорах (Рарр,1992; Баранов, 1994; Баранов и др.,

1994). Диагностика во 2-м триместре беременности нередко по-

казана для неинформативных семей в случае тех нозологий,

пренатальная диагностика которых принципиальна возможна пу-

тем биохимического тестирования первичных нарушений (напри-

мер муковисцидоз) или оценки каких-либо иных проявлений бо-

лезни у плода.

Основным источником ДНК для диагностики в постнатальном

периоде являются лимфоциты крови. Реже для этих целей ис-

пользуют другие ткани и биологические жидкости, содержащие

клеточные элементы (слюна, кости, моча). Если семья частично

информативна (идентифицируется либо доступен молекулярной

маркировке лишь один мутантный аллель), также рекомендуется

диагностика в 1-м триместре беременности, так как она позво-

ляет отвергнуть диагноз у 50% всех плодов при аутосомно-ре-

цессивных заболеваниях, что доказывается отсутствием иденти-

фицируемого мутантного аллеля. В противном случае дальнейшая

тактика определяется исходя из пожеланий женщины и возмож-

ностей для уточнения диагноза на более поздних сроках разви-

тия (II-й триместр беременности). Так, в случае пренатальной

диагностики муковисцидоза результаты молекулярных исследова-

ний могут быть дополнены биохимическим тестированием фермен-

тов амниотической жидкости на 18- 20-й неделях беременности

(Горбунова и др., 1991; Baranov et al., 1992); в случае ге-

мофилии А - прямым серологическим исследованием активности

фактора Y11 свертывания крови (Aseev et al., 1994); в случае

миодистрофии Дюшенна - иммуноцитохимическим анализом дистро-

фина в биоптатах мышц плода (Hoffman et al., 1992) и т.д.

Следует однако подчеркнуть, что современный уровень молеку-

лярных знаний о природе гена, его мутациях и полиморфизмах

позволяет в идеале проводить молекулярную диагностику наибо-

лее частых моногенных заболеваний, практически, во всех слу-

чаях. Возможности молекулярной диагностики в России пока

весьма ограничены ( Baranov, 1993 ;см. Глава X). Кроме того,

ситуация осложняется сравнительно поздним (часто, уже во

время беременности) обращением семей высокого риска на пре-

натальную диагностику, что не позволяет провести молекуляр-

ные исследования ее информативности в полном обьеме. Связано

это, в первую очередь, с плохой информированностью населения

о работе соответствующих медико-генетических служб.

Из всех существующих способов пренатальной диагностики

методы, основанные на анализе ДНК, являются наиболее точны-

ми, так как они выявляют первичные нарушения в структуре ге-

нов. Это прежде всего относится к тем заболеваниям, диагнос-

тика которых осуществляется путем прямой идентификации му-

тантных аллелей. Тем ни менее, даже в этом случае оконча-

тельное заключение о здоровье будущего ребенка хотя и приб-

лижается к абсолютному, но все же носит вероятностный харак-

тер. Основным источником ошибок при проведении пренатальной

диагностики служит возможная контаминация материала плода,

используемого для постановки диагноза, другими тканями, в

первую очередь, материнского происхождения. Поэтому сразу

после взятия диагностического материала путем биопсии хорио-

на, амниоцентеза или кордоцентеза проводят тщательную его

оценку с использованием разнообразных лабораторных методов.

Отличие молекулярных методов тестирования от биохимических

или любых других заключается в их повышенной чувствительнос-

ти и огромной разрешающей способности. Загрязнение материала

особенно опасно в тех случаях, когда прогноз дается на осно-

ве анализа амплифицированных фрагментов ДНК. Попавшие в тес-

тируемые образцы клетки чужеродного происхождения могут пос-

лужить источником донорской ДНК для ПЦР и тогда может быть

получено несоответствующее действительности заключение о

том, что ребенок будет здоров. Риск подобных ошибок может

быть значительно уменьшен при работе в стерильных условиях и

при постановке анализов в нескольких параллельных пробах.

Конечно, в любом диагностическом центре возможны лаборатор-

ные ошибки чисто технического порядка, не зависящие от ис-

пользуемых методов тестирования. Однако, достоверность прог-

нозирования, основанного на прямом анализе мутантных аллелей

плода, обычно, превышает 99%. При использовании косвенных

методов молекулярной диагностики появляется дополнительный

риск ошибки, связанный с возможностью рекомбинации между му-

тантным аллелем и маркерным локусом (особенно при больших

размерах гена, как, например, в случае гена дистрофина).

Конкретное значение этого риска зависит от взаимного распо-

ложения используемых для диагностики маркеров и соответству-

ющих мутантных аллелей. Обычно, для молекулярной диагностики

используют маркеры, частота рекомбинации которых с мутантны-

ми аллелями гена не превышает десятых, а иногда и сотых до-

лей процента.

В случае неблагоприятного прогноза в отношении здоровья

будущего ребенка решение о прерывании или продолжении бере-

менности принимают родители на основании предоставленного в

их распоряжение общего заключения. После рождения ребенка

или прерывания беременности желательно проводить верификацию

диагноза всеми доступными для этого методами, включая и те,

которые были использованы для постановки пренатального диаг-

ноза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При всем разнообразии тем, затронутых в монографии,

весь изложенный в ней материал, по-сути, касается трех

основных проблем : 4(1) 0генетическое картирование и геном че-

ловека, 4(2) 0молекулярная диагностика генных болезней, 4(3)

генокоррекция наследственных дефектов и генотерапия. В реше-

нии каждой из названных проблем достигнуты серьезные успехи.

Напомним некотрые из них.

Известно, что первый ген человека (ген цветной слепо-

ты-дальтонизма) картирован на Х-хромосоме человека в

1911г. Первый аутосомный ген - только в 1968г. К 1973 на

всех хромосомах человека было картировано всего 64 гена, а к

1994г. на генетических картах уже локализовано свыше 60 000

маркерных ДНК последовательностей (главным образом, фрагмен-

тов кДНК экспрессирующихся генов-EST см.Главу III.), а также

4более 05 000 полноразмерных структурных генов. Благодаря мно-

гочисленным полиморфным сайтам и, главным образом, микроса-

теллитным молекулярным маркерам, созданы подробные (1,5-2

сантиморганные) генетические карты для каждой хромосомы че-

ловека. Это позволило перейти от функционального к позицион-

ному картированию, т 4о 0е 4сть 0картированию новых генов не-

посредственно на физической карте ДНК целого генома.

По мнению авторитетных специалистов по генетическому

картированию таких как Питер Гудфеллоу, Поль Вайссенбах и

др 4угих, 0дальнейшее наращивание плотности молекулярных марке-

ров на хромосомах человека уже лишено смысла, тем более, что

в процессе идетификации все новых и новых генов методом EST,

новые полиморфные сайты все равно будут найдены. Не менее

оптимистично обстоят дела и с секвенированием, т 4о 0е 4сть 0вы-

яснением первичной нуклеотидной последовательности всей

двухметровой молекулы ДНК человека. Достаточно заметить, что

первоначальная стоимость секвенирования одной пары нуклеоти-

дов оценивалась в 1 $, сейчас она составляет уже около 40

центов и продолжает снижается. Причина этого - широкая авто-

матизации монотонного процесса секвенирования. Так, 10 робо-

тов фирмы Applied Biosystems за одну неделю секвенируют бо-

лее 30 000 000 п 4ар 0о 4снований. 0Дальнейшее совершенствование

технологии секвенирования 4, 0создани 4е 0принципиально новых под-

ходов (метод "чипов"-Мирзабеков А.Д., Ed.Southern ),

4повышающих в десятки раз 0степен 4ь 0автоматизации этого про-

цесса в высокоспециализированных центрах позволяет наде-

яться, что секвенирование всего генома человека будет завер-

шено в 2 006 году, а вполне вероятно и к 2 000 году!

Однако, само по себе завершение гигантского по замыслу и

грандиозного по реализации научного проекта "Геном человека"

отнюдь не означает, что процесс познания генома завершен.

Уже сейчас становится очевидным, что не существует какого-то

усредненного генома человека, каждый геном как и каждый че-

ловек сугубо индивидуален. Эта индивидуальность генома про-

является не только на уровне отдельной личности, но и на

уровне этнических групп, наций, отдельных популяций и рас

(Cavalli-Sforsa,1994). Геном человека как система динамич-

ная, очень разнообразен. Анализ этого разнообразия

(diversity) - одно из важнейших продолжений программы Геном

человека. Еще более актуальным является выяснение "функцио-

нальной карты генома". Секвенирование позволит расшифровать

порядок всех 3 4.5 0х 10 4! 09 нуклеотидов. Но ведь это только на-

чало. Определить границы генов, выяснить положение много-

численных регуляторных элементов, их интронно-экзонную

структуру и, наконец, функциональное назначение каждого из

60 000 генов, назначение которых пока неизвестно - вот сле-

дующая поистине глобальная задача молекулярной генетики.

Вполне вероятно, что именно на этом пути удастся решить за-

гадку "избыточной ДНК", понять эволюцию (филогенез) генома

человека и ,возможно, расшифровать партитуру симфонии жизни

- т 4о 0е 4сть 0последовательность включения и выключения генов в

ходе онтогенеза.

На генетические карты человека уже в 1994г. нанесено

933 гена, мутации которых приводят к различным наследствен-

ным заболеваниям, причем более 400 из них проклонированы,

т 4о 0е 4сть 0выделены в чистом виде и размножены вне оргаизма че-

ловека в составе ДНК фагов, вирусов, дрожжей и бактерий. Для

многих из этих генов, в особенности, сопряженных с наиболее

частыми, социально значимыми заболеваниями, подробно изучены

спектры мутаций, охарактеризованы аллельные полиморфизмы и

разработаны схемы молекулярной диагностики. Причем, если в

1993г. таких заболеваний было около 130 (Bob Williamson), то

в 1994 - более 600. По-сути, уже сегодня каждый наследствен-

ный недуг, ген которого картирован, доступен молекуярной ди-

агностике прямыми или косвенными методами.

Помимо моногенных болезней, проблемы молекулярной диаг-

ностики которых в значительной степени уже решены, все боль-

ше внимания сегодня уделяют мультифакториальным заболевани-

ям. На повестке дня молекулярная диагностика предрасположен-

ности к таким широкораспространенным недугам как атероскле-

роз, ишемия сердца, онкологические 4, психиатрические 0заболе-

вания, диабет и мн 4огое 0друг 4о 0е. Выяснение генетической приро-

ды этих болезней, равно как досимптоматическая диагностика

многих моногенных болезней с поздней манифестацией, ставит

перед исследователями 4, 0т 4о 0е 4сть 0молекулярными биологами и

врачами 4, 0проблему целесообразности такой досимптоматической

диагностики, права личности на исключительность знаний о

собственном геноме, точнее о тех мутациях и генетических

предрасположенностях которые закодированы в нем еще до рож-

дения. Для некоторых заболеваний 4( 0муковисцидоз, фенилкетону-

рия) такая ранняя диагностика, безусловно, целесообразна,

так как позволяет начать лечение до начала заболевания. Для

тех же нозологий, где реальной терапии пока нет (хорея Ген-

тингтона, другие болезни "экспансии", миодистрофия Дюшенна и

др.) целесообразность такой диагностики и, главное, конфи-

денциальность полученной информации широко обсуждаются.

Да, уже сейчас вполне реально говорить о "генетическом

паспорте новорожденных", т 4о 0е 4сть 0о том, что уже вскоре после

рождения с помощью автоматизированной системы удасться проа-

нализировать весь спектр наиболее частых мутаций широко

распространенных заболеваний как моногенной так и мультифак-

ториальной природы 4, в 0том числе и генов, мутации которых с

высокой вероятностью могут привести к раку молочной железы,

толстого кошечника, к атеросклерозу, диабету и мн 4огим 0другим

ттяжелым недугам. Жить 4, 0н 4и 0в чем себя не ограничивая, засу-

нув как страус голову в песок, либо, зная, что у вас мутация

в гене глутатионтранферазы, а следовательно, высока вероят-

ность болезней легких (особенно рака) воздержаться от куре-

ния ? Что лучше, добровольные ограничения и периодические

осмотры или состояние счастливого неведения, грозящее неми-

нуемой катастрофой ? А сколько мультифиакториальных заболе-

ваний можно избежать, зная о слабых и сильных сторонах свое-

го генома! В настоящее время в США провдятся массовые опросы

населения, цель которых выяснить целесообразность досимпто-

матической диагностики в семьях высокого риска, доступность

(конфиденциальность) этой информации для членов семьи, нани-

мателей, страховых компаний и пр. Иными словами, практически

овладев плодом Древа Познания - собственным геномом- челове-

чество поставлено перед дилеммой как сделать так, чтобы

польза от него оказалась много весомее, чем потенциальный

вред. Неслучайно, сегодня уже на новом, молекулярном уровне

всплывают идеи "улучшения человеческой породы " Фрэнсиса

Гальтона, правда, неимеющие ничего общего с примитивной ев-

геникой прошлого. Обрели реальность и казавшиеся невозможны-

ми в недалеком прошлом идеи патентования отдельных генов и

их фрагментов, потенциально особенно перспективных для моле-

кулярной диагностики и биотехнологий. Несмотря на протесты

руководителей программы "Геном человека" Фрэнсиса Коллинса,

Томаса Каски и широкой научной общественности патент-

носпособность генома человека, по крайней мере, его отдель-

ных фрагментов, генов (например, гена BRCA-1- мутации кото-

рого резко увеличивают вероятность рака молочной железы) по-

лучила одобрени 4е 0 законодательных комитетов США

Еще больше этических и моральных вопросов порождает ге-

нотерапия. Однако, и в этой области наметилась определенная

эволюция взглядов как специалистов, так и широкой обществен-

ности. От полной неприемлемости такого подхода в 70-80-х го-

да 4х 0уходящего века до признания безопасности (при соблюдении

необходимых правил) генноинженерных манипуляций на сомати-

ческих клетках. Между тем, логика подсказывает, что по мере

того как все больше соматических мутаций удастся исправить с

помощью генной терапиии, тем значительней будет их вклад на

уровне половых клеток. Тем больше будет шанс того, что 4при

4вступлении 0в брак гомозигот по аутосомно-рецессивным заболе-

ваниям 4(а вероятность такого события будет возрастать по

4мере совершенствования методов лечения генетических

4болезней) 0, все дети 4будут здоровы, хотя и получат от своих

4родителей мутантные гены. Это станет особенно реальным в

4связи с успешной разработкой методологии доимплантационной

4диагностики наследственных болезней. Поэтому 0в научной лите-

ратуре все настойчивее звучит тема генокоррекции на уровне

половых клеток или ранних зародышей человека. Современный

методоческий уровень пока еще не позволяет с абсолютной уве-

ренностью осуществлять направленный перенос гена в половые

клетки и клетки дробящихся зародышей. Пока этого удалось

достичь только в экспериментах с эмбриональными стволовыми

клетками, причем на 1-м этапе возникший организм, в действи-

тельности, является мозаиком по введенному гену (см. Главу

V 4I 0II). Естественно, это не означает, что проблема гомолого-

гичной рекомбинации нормального и мутантного гена на уровне

половых клеток и ранних зародышей принципиально неразрешима.

Однако, потребуется еще много времени, возможно не одно

десятилетие XXI-го века, прежде, чем эта задача будет успеш-

но решена. В настоящее время мнение специалистов и широкой

общественности - максимально предотвратить возможность попа-

дания чужеродного генетического материала в половые клетки,

с тем, чтобы избежать непредсказуемых, а, скорее всего,

весьма печальных, последствий для человечества такого

трансгеноза.

Нет, однако,сомнений в том, что, если конец ХХ-го века

ознаменован расшифровкой молекулярной структуры генома чело-

века, то век XXI прославится выяснением его функций на уров-

не отдельных генов, генных сообществ, хромосом , также всего

генома вцелом в контролировании процессов онто- и филогене-

за.

Молодым людям, вступающим в ХХI век, необходимо знать,

4на каком этапе 0находится наука 4о структуре и функциях 0геном 4а

человека. Это важно не только с сугубо утилитарных, меди-

цинских позиций (хотя и этот аспект крайне важен), но и с

позиций общечеловеческих. Ибо всякое эпохальное открытие на-

уки (а именно таковым и является расшифровка генома челове-

ка) до недавнего времени использовалось не только во благо,

но и во вред человечеству ( 4п 0ечальный пример тому - открытие

расщепления ядра урана, породившее атомную бомбу). Неразум-

ные эксперименты с геномом человека могут привести к еще бо-

лее страшным последствиям. Уберечь генофонд человечества,

всячески оберегая его от рискованных вмешательств, и при

этом извлечь максимальную выгоду из уже полученной бесценной

информации в плане диагностики, профилактики и лечения мно-

гих тысяч наследственно обусловленных недугов - вот задача,

которую необходимо решать уже сегодня 4и 0с которой мы прийдем

в новый XXI век !

ГЛАВА IX.

ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ.

Раздел 9.1 Определение, историческая справка, програм-

мы генной терапии.

В широком смысле слова генная терапия означает лечение

путем введения в ткани или в клетки пациента смысловых пос-

ледовательностей ДНК. Первоначально генная терапия рассмат-

ривалась как возможность исправления дефекта в гене. Счита-

лось, что основным обьектом для такого лечения будут служить

моногенные наследственные заболевания человека, причем тео-

ретически представлялась вероятной коррекция генного дефекта

как на соматическом уровне, так и на уровне зародышевых (по-

ловых) клеток. Многочисленные эксперименты по созданию

трансгенных животных, начатые после 1980 г., а также на

культурах клеток внесли существенные коррективы в эти теоре-

тические представления. Во-первых, оказалось значительно

проще исправлять не сам дефект в гене, то есть заменять весь

мутантный ген или его мутированный фрагмент на нормальный, а

вести коррекцию путем введения в организм пациента полноцен-

но работающего гена (обычно его кДНК). Во-вторых, несмотря

на решающие успехи генной инженерии последних лет, исследо-

вания по геннной терапии у человека осуществляются исключи-

тельно на соматических тканях, в которых в норме происходит

экспрессия дефектного гена. Генная терапия на уровне половых

и зародышевых клеток человека ввиду возможных серьезных пос-

ледствий для генофонда человечества представляются весьма

проблематичной и на данном этапе наших знаний - малореаль-

ной. И наконец, в-третьих, уже разработанная и применяемая

на практике методология генной терапии оказалась пригодной

для лечения не только моногенных наследственных заболеваний,

но и таких широко распространенных болезней, какими являются

злокачественные опухоли, многие виды тяжелых вирусных инфек-

ций, включая спид, сердечно-сосудистые и другие заболевания.

Учитывая эти обстоятельства, генную терапию на современном

этапе можно определить как лечение наследственных, онкологи-

ческих, некоторых инфекционных (вирусных) и других заболева-

ний путем введения генов в клетки пациентов с целью направ-

ленного изменения генных дефектов, либо придания клеткам но-

вых функций (Culver, 1994). Первые клинические испытания ме-

тодов генной терапии были предприняты 22 мая 1989г. с целью

генетического маркирования опухоль-инфильтрующих лимфоцитов

в случае прогрессирующей меланомы. Маркированные прокариоти-

ческим геном neo, Т-лимфоциты были устойчивы к неомицину и

могли быть легко отселектированы в культуре, что позволило

детально проследить их судьбу в кровотоке и избирательное

накопление в опухолях (подробней см. 9.5).

Первым моногенным наследственным заболеванием, в отно-

шении которого были применены методы генной терапии, оказал-

ся наследственный иммуннодефицит, обусловленный мутацией в

гене аденозин-дезаминазы. 14 сентября 1990г.в Бетезде (США)

4-х летней девочке, страдающей этим достаточно редким забо-

леванием (1 : 100 000), были пересажены ее собственные лим-

фоциты, предварительно трансформированные ex vivo геном ADA

(ген ADA + ген neo + ретровирусный вектор). Лечебный эффект

наблюдался в течение нескольких месяцев, после чего процеду-

ра была повторена с интервалом 3-5 месяцев (Anderson, 1992;

Culver, 1994). В течение 3-х лет терапии в общей сложности

проведено 23 внутривенных трансфузии ADA-трансформированных

Т-лифоцитов без видимых неблагоприятных эффектов. В резуль-

тате лечения состояние пациентки (Ашанти В. ДеСильва) нас-

только улучшилось, что она смогла вести нормальный образ

жизни и не бояться случайных инфекций. Столь же успешным

оказалось и лечение второй пациентки с этим заболеванием

(подробней см. раздел 9.5). В настоящее время клинические

испытания генной терапии этого заболевания проводятся в Ита-

лии, Франции, Великобритании и Японии.

Другие моногенные наследственные заболевания, в отноше-

нии которых уже имеются официально разрешенные протоколы и

начаты клинические испытания, касаются семейной гиперхолес-

теринемии (1992); муковисцидоза (1993); гемофилии В (1992);

болезни Гоше (1993). В отношении многих других заболеваний

медицинские протоколы клинических испытаний находятся в ста-

дии утверждения (см. раздел 9.5.). К 1993г. только в США к

клиническим испытаниям генно-инженерных конструкций на чело-

веке было допущено 53 проекта (Culver, 1994). К 1995г. в ми-

ре число таких проектов возросло до 100 и более 400 пациен-

тов было непосредственно вовлечено в эти исследования (Hodg-

son, 1995). Подавляющее большинство таких проектов (86) ка-

салось лечения онкологических заболеваний, а также спида.

Таким образом, от опытов на животных и теоретических

построений 80-х годов уже в 1990 году удалось приступить к

реальному лечению моногенных заболеваний, число которых

стремительно нарастает. Естественно, что подобные революци-

онные перемены могли возникнуть только в результате решающих

успехов молекулярной биологии в картировании генов, мутации

которых приводят к наследственным заболеваниям (см.Главу

III), выяснении молекулярной природы этих мутаций (см.Главу

IV), успехов в секвенировании и клонировании генов (см.Главы

I и II), создании генно-инженерных конструкций (см.Главу

II), отработки и совершенствования методов их доставки

(см.ниже). Следует также подчеркнуть, что качественный ска-

чок в области генной терапии, когда сам ген стал рассматри-

ваться как лекарственный препарат, стал возможен благодаря

тому, что предшествующие экспериментальные и клинические

исследования доказали безопасность генной терапии.

Вместе с тем, и в сегодняшних исследованиях по генной

терапии необходимо учитывать, что последствия манипулирова-

ния генами или рекомбинантными ДНК in vivo изучены недоста-

точно. Следует помнить, что введение в организм человека

последовательностей ДНК, не находящихся под контролем свойс-

твенных им регуляторных элементов, может приводить к трудно

предсказуемым измененим метаболических процессов и сопровож-

даться функциональным дисбалансом. Современные представления

о структуре генома и его взаимодействиях с экзогенными ДНК и

вирусными последовательностями, часто используемыми в ка-

честве векторов для переноса генов (см. 9.2), могут оказать-

ся недостаточными для прогнозирования возможных нежелатель-

ных или неконтролируемых последствий такого вмешательства.

Поэтому при разработке программ генной терапии принципиаль-

ное значение имеют вопросы безопасности предлагаемых схем

лечения как для самого пациента, так и для популяции в целом

(Anderson, 1992; Miller, 1992). Важно, чтобы при проведении

испытаний ожидаемый лечебный эффект или возможность получе-

ния дополнительной полезной информации превосходили потенци-

альный риск предлагаемой процедуры. Неслучайно, в странах с

наиболее продвинутым уровнем исследований в этой области,

особенно в США, медицинские протоколы с использованием смыс-

ловых последовательностей ДНК подвергаются обязательной экс-

пертизе в соответствующих комитетах и комиссиях. Клинические

испытания предложенной генотерапевтической процедуры возмож-

ны только после ее одобрения соответствующим законодательно

утвержденным органом. В США таковыми являются: Консультатив-

ный Комитет по Рекомбинантным ДНК (Recombinant DNA Advisory

Committee - RAC), Комитет по лекарствам и пищевым продуктам

(Food and Drug Administration -FDA), с последующим обяза-

тельным утверждением проекта директором Национального Инсти-

тута Здоровья (National Institute of Health) (Miller, 1992;

Anderson, 1992; Culver, 1994). В Европе такие протоколы сос-

тавляются и утверждаются в соответствии с рекомендациями Ев-

ропейской Рабочей Группы по Переносу Генов и Генной Терапии

(European Working Group on Human Gene Transfer and Therapy)

(Cohen-Haguenauer, 1995). Программы генной терапии для кли-

нических испытаний должны включать следующие разделы: обос-

нование выбора нозологии для проведения курса генной тера-

пии; определение типа клеток, подлежащих генетической моди-

фикации; схему конструирования экзогенной ДНК; обоснование

биологической безопасности вводимой генной конструкции,

включающая опыты на культурах клеток и на модельных (транс-

генных) животных; разработку процедуры ее переноса в клетки

пациента; методы анализа экспрессии введенных генов; оценку

клинического (терапевтического) эффекта; возможные побочные

последствия и способы их предупреждения (Culver, 1993; Co-

hen-Haguenauer, 1995).

Важнейшим элементом в программе генной терапии является

анализ последствий проводимых процедур. Этот контроль прово-

дят на всех этапах терапии, причем исследования выполняют на

различных уровнях. Прежде всего, после переноса гена осу-

ществляют поиск модифицированных клеток в организме пациента

и следят за динамикой этих клеток в определенных тканях.

Этот поиск может быть облегчен при наличии маркерного гена в

конструкции. Присутствие последовательностей экзогенной ДНК

в модифицированных клетках чаще всего идентифицируют с по-

мощью ПЦР. На следующем этапе производят анализ экспрессии

введенных генов путем идентификации и количественной оценки

соответствующего РНК-транскрипта, либо белкового продукта

гена. В тех случаях, когда это возможно, проводят анализ

коррекции первичного биохимического дефекта. Затем, все по-

лученные данные сопоставляют с результатами комплексного ме-

дицинского обследования и вносят необходимые исправления и

добавления в проводимую схему лечения.

Раздел 9.2. Типы генотерапевтических вмешательств, вы-

бор клеток-мишеней.

Рассмотрим наиболее общие принципы, лежащие в основе

построения программ генной терапии. Итак, генная терапия

предполагает введение последовательностей ДНК в клетки-мише-

ни. Она проводится либо с целью коррекции наследственной па-

тологии, возникшей вследствие генетического дефекта, либо

для придания этим клеткам новых функций, способствующих уст-

ранению патологических процессов. В первом случае, в орга-

низм больного вводят нормально работающий гомолог дефектного

гена. Второй подход применяют при лечении, таких заболева-

ний, как опухоли или инфекции. В этих случаях вводят гены,

обладающие условным цитотоксическим эффектом или способству-

ющие формированию выраженного иммунного ответа. Мишенями для

таких генов служат пораженные ткани, иммунные клетки, специ-

фическим образом проникающие в эти ткани, либо предваритель-

но трансформированные in vitro другие клетки. Таким образом,

в зависимости от характера заболевания и предполагаемого ге-

нотерапевтического подхода объектом генетической трансфекции

могут служить самые разные соматические клетки, как несущие

дефектный ген, так и нормальные клетки, приобретающие тера-

певтические свойства после трансфекции. В зависимости от

способа введения экзогенных ДНК в геном пациента генная те-

рапия может проводиться либо в культуре клеток (ex vivo),

либо непосредственно в организме (in vivo). Клеточная генная

терапия или терапия ex vivo предполагает выделение и культи-

вирование специфических типов клеток пациента, введение в

них чужеродных генов, отбор трансфецированных клеток и реин-

фузию их тому же пациенту (Рис. 9.1). В настоящее время

большинство допущенных к клиническим испытаниям программ

генной терапии использует именно этот подход (Cul-

ver, 1994). Осуществление таких программ возможно лишь в

крупных специализированных центрах, требует больших матери-

альных затрат и высоких биотехнологий.

Генная терапия in vivo основана на прямом введении кло-

нированных и определенным образом упакованных последователь-

ностей ДНК в специфические ткани больного. При этом вводимые

ДНК, как правило, интегрируют с молекулами, обеспечивающими

их адресную доставку в клетки-мишени (см. 9.3). Этот очень

перспективный подход, расчитанный на массовое лечение широко

распространенных заболеваний, пока реально апробирован толь-

ко для лечения муковисцидоза (Crystal et al., 1994). Особен-

но перспективным для лечения генных болезней in vivo предс-

таляется введение генов с помощью аэрозольных или иньецируе-

мых вакцин. Аэрозольная генотерапия разрабатывается, как

правило, для лечения пульмонологических заболеваний, таких

как муковисцидоз, энфизема, рак легких, при которых обьекта-

ми генетической модификации являются специфические типы ле-

гочных клеток (Hoffman, 1991). Иньецируемые вакцины могут

использоваться для модификации различных типов клеток и со

временем, по-видимому, станут наиболее распространенным и

универсальным способом доставки чужеродного генетического

материала в любые ткани.

Эффективность курса генной терапии в значительной сте-

пени зависит от правильного выбора типов соматических кле-

ток, в которых должна бать проведена генетическая модифика-

ция. Так например, при лечении какого-либо наследственного

заболевания, обусловленного дефектом секреторного белка, ге-

нетической коррекции, в принципе, могут быть подвергнуты лю-

бые клетки, тогда как для нерастворимых или мембран-связан-

ных белков выбор ограничен теми клетками, где экспрессирует-

ся соответствующий ген (см.раздел 8.5). Разработке программы

генной терапии предшествуют тщательный анализ тканеспецифи-

ческой экспрессии соответствующего гена, идентификация пер-

вичного биохимического дефекта, исследование структуры,

функции и внутриклеточного распределения его белкового про-

дукта, а также биохимический анализ патологического процес-

са. Все эти данные учитываются при составлении соответствую-

щего медицинского протокола. Кроме того, план генотерапевти-

ческих вмешательств определяется также доступностью кле-

ток-мишеней, периодом их жизни и характером миграции в орга-

низме, эффективностью и специфичностью трансфекции кле-

ток, длительностью экспрессии введенного гена.

Наиболее перспективной представляется возможность гене-

тической модификации не самих уже дифференцированных клеток

с наследственным дефектом, а их предшественников, то есть

долго живущих стволовых клеток. В частности, многообещающей

является трансформация тотипотентных эмбриональных стволовых

клеток, которые при создании определенных микроусловий могут

дифференцироваться, практически, в любые соматические клетки

организма (Hodgson, 1995). Следует упомянуть в этой связи

предложенный недавно эффективный метод получения стволовых

клеток гемопоэтического ряда, перспективных для генотерапии

наследственных заболеваний крови (Berardi et al., 1995).

Как правило, определение типа клеток, подлежащих гене-

тической модификации, завершается оценкой результатов пере-

носа гена в системе in vitro и проведения экспериментов на

животных моделях в тех случаях, когда это возможно. Апроба-

цию процедуры генокоррекции наследственного заболевания про-

водят на первичных культурах экспрессирующих клеток больного

либо на перевиваемых культурах, полученных после предвари-

тельной трансформации первичных культур. На этих клеточных

моделях оценивают эффективность выбранной системы переноса

экзогенной ДНК, определяют экспрессию вводимой генетической

конструкции, анализируют ее взаимодействие с геномом клет-

ки, отрабатывают способы идентификации первичного дефекта и

его коррекции на биохимическом уровне.

Однако, многие проблемы генной терапии не могут быть

решены на уровне клеток. Важное значение имеет анализ влия-

ния введенных ДНК-последовательностей на межклеточные взаи-

модействия, определяющие работу соответствующих тканей и ор-

ганов. Такие исследования могут быть проведены только in vi-

vo. Так, например, в культуре клеток можно определить коли-

чество синтезированного белка, необходимое для нормализации

биохимического дефекта, но этих данных недостаточно для от-

вета на вопрос, какое количество клеток в организме должно

быть модифицировано для восстановления нарушенной функции.

Используя культуры клеток, можно разработать биохимическую

систему адресной доставки рекомбинантных ДНК, однако, про-

верка надежности работы этой системы может быть осуществлена

только на уровне целого организма. Показатели длительности и

характера экспрессии введенного гена в культуре клеток могут

использоваться лишь в качестве ориентировочных параметров

для оценки необходимой периодичности повторения терапевти-

ческих процедур. Кроме того, многие побочные эффекты и, в

первую очередь, возможные ошибки в регуляции эспрессии чуже-

родного гена и опасность вирусной контаминации в результате

использования компетентного по репликации вектора (см.ниже),

могут быть выявлены только in vivo. Поэтому такое внимание в

программах по генной терапии уделяется экспериментам in vivo

на естественных или искусственно полученных моделях соот-

ветствующих наследственных болезней у животных (см.Главу

VIII). Успешная коррекция генетических дефектов у таких жи-

вотных и отсутствие нежелательных побочных эффектов генной

терапии является важнейшей предпосылкой для разрешения кли-

нических испытаний.

Раздел 9.3 Методы генетической трансфекции в генной те-

рапии.

Решающим условием успешной генотерапии является обеспе-

чение эффективной доставки, то есть трансфекции (в широком

смысле) или трансдукции (при использовании вирусных векто-

ров) чужеродного гена в клетки-мишени, обеспечение длитель-

ной персистенции его в этих клетках и создание условий для

полноценной работы, то есть экспрессии. Трансфекция может

проводиться с использованием (1) чистой ("голой"-naked) ДНК,

лигированной в соответствующую плазмиду, либо (2) комплекси-

рованной ДНК - плазмидная ДНК комплексированная с солями,

белками (трансферрином), органическими полимерами (DEAE -

декстраном, полилизином, липосомами или частицами золота),

либо (3) ДНК в составе вирусных частиц, предварительно ли-

шенных спсобности к репликации. Залогом длительной персис-

тенции чужеродной ДНК в клетках-реципиентах является ее

встраивание в геном, то есть в ДНК клетки-хозяина. Пребыва-

ние экзогенной ДНК в ядре в свободном состоянии (в виде, так

называемых, эписом) с неизбежностью ведет к ее элиминации

даже в неделящихся клетках и, соответственно, к транзиторной

экпрессии (обычно, в течение нескольких месяцев). Необходи-

мой предпосылкой экспрессии чужеродной ДНК является наличие

соответствующих промоторов, причем в случае наличия тканес-

пецифических промоторов можно добиться экспрессии введенного

гена только в определенных тканях и клетках (см.ниже). Ос-

новные методы доставки чужеродных генов в клетки подразделя-

ются на химические, физические и биологические. Эффектив-

ность трансфекции и интеграционная способность трансдуциро-

ванной чужеродной ДНК при различных способах трансфекции в

ДНК-клетки мишени приведены в Табл.9.1.

Таблица 9.1. Основные характеристики генетической трансфек-

ции in vitro (Culver, 1994).

--------------------T------------T-------------T------------¬

¦ Методы ¦ Трансдукция¦ Иинтеграция ¦Экспрессия ¦

+-------------------+------------+-------------+------------+

¦ Химические: ¦ ¦ ¦ ¦

¦ Са-фосфат ¦ ¦ ¦ ¦

¦ преципитация ¦ низкая ¦ низкая ¦трнзиторная ¦

+-------------------+------------+-------------+------------+

¦ Физические: ¦ ¦ ¦ ¦

¦ Электропорация ¦ низкая ¦ низкая ¦транзиторная¦

¦ Микроинъекция ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦

¦ "Бомбардировка" ¦ ¦ ¦ ¦

¦ частицами золота ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦

+-------------------+------------+-------------+------------+

¦Слияние: ¦ ¦ ¦ ¦

¦Липосомы ¦ низкая ¦ низкая ¦транзиторная¦

¦Рецептор-опосредо- ¦ ¦ ¦ ¦

¦ванный эндоцитоз: ¦ ¦ ¦ ¦

¦ДНК-белковый ¦ ¦ ¦ ¦

¦комплекс ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦

¦ДНК-комплекс- ¦ ¦ ¦ ¦

¦вирусная капсида ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦

+-------------------+------------+-------------+------------+

¦Рекомбинантные ¦ ¦ ¦ ¦

¦вирусы: ¦ ¦ ¦ ¦

¦Аденовирус ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦

¦Адено-ассоцииро- ¦ ¦ ¦ ¦

¦ванный вирус (AAV) ¦ высокая ¦ низкая ¦длительная ?¦

¦Вирус герпеса (HSV)¦ низкая ¦ низкая ¦слабая ¦

¦Вирус иммуно- ¦ ¦ ¦ ¦

¦дефицита (HIV) ¦ высокая ¦ высокая ¦длительная ?¦

¦Вирус мышиной лейке¦ ¦ ¦ ¦

¦мии Молони (MoMLV) ¦ высокая ¦ высокая ¦длительная ?¦

¦Вирус ветряной ¦ ¦ ¦ ¦

¦оспы (Vaccinia) ¦ высокая ¦ низкая ¦слабая ¦

L-------------------+------------+-------------+-------------

Как следует из представленных данных, введение чужерод-

ных генов in vitro может быть весьма эффективно как при по-

мощи некоторых физических способов доставки (электропоации,

бомбардировки частицами золота), так и, практически, при

всех вариантах биологической доставки, особенно, с помощью

рекомбинантных вирусов. Однако, реально интеграция в геном

клетки-реципиента может быть достигнута только в случае рет-

ровирусных или адено-ассоциированных векторов, обладающих

необходимыми для встраивания в эукариотическую ДНК свойства-

ми. При этом отсутствие встраивания в геномную ДНК, как пра-

вило, коррелирует с транзиторной (временной) экспрессией ге-

на. Следовательно, только вирусные векторы или генетические

конструкции, включающие вирусные последовательности способны

к активной трансфекции, а в ряде случаев и к длительной экс-

прессии чужеродных генов. Следует напомнить в этой связи,

что из 100 уже одобренных проектов генотерапии 95 предпола-

гают использовать вирусную трансдукцию и 86 из них основаны

на применении ретровирусных векторов.

Несмотря на усилия многих генно-инженерных лабораторий,

Центров, а в последнее время и фармацевтических фирм, от-

сутствие идеальных векторов, обладающих эффективной (100%)

трансфекцией как ex vivo так и in vivo, в сочетании с высо-

кой пакующей способностью (включение генетической конструк-

ции от 1 до 1 000 тысяч п.о.), интегрирующих в геном или не-

интегрирующих, но обеспечивающих длительную и, что особенно

важно, регулируемую экспрессию, при отсутствии опасности он-

когенных модификаций или иных нежелательных побочных эффек-

тов, продолжает оставаться одним из серьезных препятствий на

пути внедерения генотерапии (Hodgson, 1995).

Раздел 9.4. Конструирование векторных систем и совер-

шенствование методов трансформации клеток

человека.

9.4.1. Основные векторные системы.

В Табл.9.1 приведены основные типы векторных систем.

Остановимся подробнее на способах их конструирования, преи-

муществах и недостатках, некоторые из которых уже упомина-

лись в предыдущем разделе. Как правило, вводимая генетичес-

кая конструкция представляет собой полноразмерную кДНК-овую

последовательность определенного гена, инсертированную в

экспрессионный вектор, то есть находящуюся под действием

сильного промотора. Выбор подходящего промотора зависит от

многих параметров, главным из которых является необходимый

уровень экспрессии гена в клетках-мишенях. Вектор часто со-

держит один из маркерных генов, таких как гены neo, бе-

та-Gal, ген люциферазы и др., присутствие которых в трансду-

цированных клетках может быть легко обнаружено по наличию

либо соответствующего белкового продукта (гистохимически для

генов бета-Gal и люциферазы), либо маркерных последователь-

ностей ДНК. Если в качестве маркера выбран селектируемый ген

(neo), отбор клеток, трансфецированных in vitro, может про-

изводиться автоматически на соответвтвующих селективных сре-

дах. Существует два типа конструкций; один - на основе плаз-

мидной ДНК, другой - на базе вирусов. Плазмидные конструкции

удобны для клонирования, генно-инженерных манипуляций и по-

лучения большого количества рекомбинантной ДНК. Однако, бак-

териальные плазмиды, в отличие от вирусных конструкций, не

способны самостоятельно проникать в эукариотические клетки.

Для введения инсертированной в плазмиду экзогенной ДНК в

клетки человека необходимо перенести ее в подходящий вирус-

ный вектор или применить способ, облегчающий ее прохождение

через клеточные мембраны.

9.4.2 Методы физического переноса чужеродной ДНК в

клетки эукариот.

Уместно заметить, что чужеродная ДНК может спонтанно

проникать в клетки эукариот, благодаря наличию на наружных

клеточных мембранах белков, специфически связывающих ДНК.

Путем эндоцитоза (впячивания внутрь клеточной мембраны) чу-

жеродная ДНК попадает в цитоплазму в составе эндосом, где

обычно быстро разрушается лизосомальными ферментами. Только

небольшая часть экзогенной ДНК выходит из эндосом, попадает

в ядро и, если не разрушается эндогенными нуклеазами, то мо-

жет быть интегрирована в ДНК клетки. Такое, однако, случает-

ся достаточно редко. Известное исключение составляют мышцы,

в которых благодаря низкой активности эндогенных нуклеаз и

низкой пролиферативной активности введенная ДНК долго (до 1

года) может сохраняться и даже экспрессироваться в миофиб-

риллах (Hansen et al.,1991).

Эффективная доставка чужеродной ДНК непосредственно в

ядро клетки-мишени может быть достигнута путем микроинъекции

(метод применяемый сегодня почти исключительно для создания

трансгенных животных путем введения экзогенной ДНК в пронук-

леус оплодотворенной яйцеклетки - cм.Главу VIII); при помощи

электропорации (кратковременного воздействия сильным элект-

рическим полем); путем перфорации клеточных мембран золотыми

или вольфрамовыми микрочастицами коньюгироваными с чужерод-

ными ДНК и разогнанными до высокой скорости (метод бомбарди-

ровки). Эти методы доставки применимы, главным образом, для

клеток, культивируемых in vitro. Исключение составляет лишь

метод бомбардировки, который при наличии специального генно-

го "ружья" с успехом применяется и in vivo (Yang et

al., 1990).

Для повышения эффективности переноса обычно используют

системы доставки - соединения или группы соединений, взаимо-

действующие с ДНК с образованием компактных структур, облег-

чающих проникновение ДНК в клетки и защищающих ее от дейс-

твия нуклеаз (Власова и др., 1994). Самой простой системой

доставки является система кальций-фосфатной копреципитации,

широко применяемая для трансфекции клеток in vitro. Более

сложный и многообещающий вариант трансфекции представляет

собой рецептор-опосредованный транспорт, предусматривающий

создание достаточно сложной, обычно трехкомпонентной конс-

трукции: ДНК-поликатион + лиганд + вирус (Рис. 9.2). В ка-

честве лигандов используются специфические белки, такие как

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14