: Литература - Другое (книга по генетике)

: Литература - Другое (книга по генетике)

го рождения больного ребенка может достигать 14% (Essen et

al.,1992).

У многих пациентов с миопатией Дюшенна при иммуногисто-

химическом окрашивании мышц обнаруживаются редкие дистро-

фин-положительные волокна. Однако, при использовании антител

с антигенными детерминантами, кодируемыми делетированным

участком гена, окрашивания не происходит и это позволяет от-

вергнуть гипотезу соматического мозаицизма. Наиболее вероят-

ный механизм такого явления - возникновение второй сомати-

ческой делеции в мышечных клетках, устраняющей сдвиг рамки

считывания, вызванный основной делецией. В результате му-

тантный ген может транскрибироваться с образованием стабиль-

ного, хотя и аномального дистрофина (Klein et al.,1992).

Имеется модельная линия мышей с миодистрофией Дюшенна -

mdx. Эта модель была получена в результате отбора мутации,

спонтанно возникшей в C57BL/10 линии (Bulfield et al.,

1984). В мышцах и в мозгу у мышей этой линии обнаруживается

резко сниженное количество Dmd-мРНК, однако дистрофин пол-

ностью отсутствует. Несмотря на это, никаких видимых клини-

ческих аномалий у mdx-мышей не наблюдаются. Идентифицирована

нонсенс мутация в mdx-гене, в результате которой у мышей

транслируется лишь 27% дистрофинового полипептида. Обнаруже-

на также сплайсинговая мутация, приводящая к вырезанию экзо-

на 7 DMD-гена у собак (Sharp et al., 1992).

В серии экспериментов на mdx-мышах доказана принципи-

альная возможность генокоррекции МД. Появление дистрофина

человека в сарколемме мышечных волокон mdx-мышей наблюдали

после введения ретровирусных или аденовирусных генноинженер-

ных конструкций, содержащих полноразмерную кДНК гена дистро-

фина (14 кб) или его делетированную, но функционально актив-

ную форму, так называемый мини-ген (6.3 кб) (Wells et al.,

1992; Cox et al., 1993; Aсsadi et al., 1995). После внутри-

венного введения фрагментов Dmd-гена в составе рекомбинант-

ного аденовируса наблюдали длительное присутствие экзогенной

ДНК в скелетных и сердечных мышцах животных

(Srataford-Perricaudet et al., 1992). Несмотря на эти оче-

видные успехи, проблема генноинженерной коррекции МД еще да-

лека от своего решения. До сих пор ведутся оживленные дебаты

исследователей о перспективности генной терапии МД по срав-

нению с клеточной терапией (пересадка здоровых эмбриональных

миобластов). Пока не утверждена ни одна программы клини-

ческих испытаний генотерапевтического подхода МД (см.Главу

IX). Основная сложность проблемы генокоррекции - необходи-

мость обеспечения системы эффективной доставки гена дистро-

фина в миофибриллы не только скелетных мышц, но, что особен-

но важно - в мышцы сердца и диафрагмы. В 1995г. исследования

по генотерапии МД начаты в рамках программы Геном человека и

в нашей стране.

10.4.3 Гемофилия А.

Гемофилия А - сцепленное с полом заболевание, вызванное

наследственным дефектом фактора VIII, важнейшего звена в

системе свертывания крови (cм. Табл. 10.4). Комплекс фактора

YIII с молекулярным весом более 1 миллиона состоит из 2-х

компонентов. Главный компонент - YIIIC, кодируется геном

F8C, локализованным в X-хромосоме. С YIIIC нековалентно свя-

зан фактор Виллебранда - YIIIR, кодирующийся аутосомным ге-

ном. Фактор Виллебранда стабилизирует фактор VIII и регули-

рует его активность.

Ген F8C - одним из очень крупных генов человека; содер-

жит 26 экзонов (размером от 69 до 3106 нуклеотидов). Общая

длина интронов соствляет 177 кб; около 20% этой ДНК прихо-

дится на интрон 22 (32.4 кб). мРНК гена F8С размером 9 009

нуклеотидов включает 5'нетранслируемую последовательность

(150 п.о.), 3'нетранслируемую последовательность (1 806

п.о.) и кодирующий фрагмент (7053 п.о.). Внутри гена F8 в

интроне 22 локализовано еще два других структурных гена не-

известной природы - F8А и F8В, что было обнаружено методами

молекулярный анализ. Ген F8A, целиком локализованный в инт-

роне 22 гена F8C, не содержит интронов и транскрибируется в

направлении, противоположном фактору VIII (3'-5'). Первый

экзон гена F8B также расположен в интороне 22, а следующие

его области распределены до экзонов 23-26; транскрибируется

он в том же направлении, что и ген F8C (5'-3'). Оба гена

экспрессируются во всех тканях (Levinson et al.,1990;

Freije,Schlessinger, 1992; Lakich et al., 1993). Интрон 22

оказался необычным и в том отношении, что содержит CpG-ост-

ровок на расстоянии около 10 кб от экзона 22 - предположи-

тельное место локализации бинаправленного промотора для ге-

нов F8A и F8B. Оказалось, что на расстоянии примерно 500 кб

в 5-'направлении от гена F8 находятся еще 2 транскрибируемые

копии гена F8A (Lakich et al.,1993).

Во время процессинга первичного белкового продукта гена

F8C от исходного пептида из 2 351 аминокислотных остатка от-

щепляется последовательность в 335 аминокислотных остатка. В

плазме крови фактор VIII существует в виде металлозависимого

гетеродимера, состоящего из С-концевой легкой цепи (80 кД) и

N-концевой тяжелой цепи (200 кД). Половина всех больных с

гемофилией A не имеют фактора VIII, 5%- имеют нормальное ко-

личество нефункционирующего белка и в остальных случаях ак-

тивность белка сохранена, но его количество резко снижено

(McGinnis et al.,1993).

Изолированные случаи гемофилии A составляют 30%; 70% -

семейные варианты. Показано, что мутации в гене F8 возникают

в сперматогенезе в 3 - 5 раз чаще, чем в оогенезе (Rosendaal

et al., 1990; Brocker-Vriends et al., 1991). Это означает,

что в 80-86% спорадических случаев матери являются носителя-

ми мутации, возникшей в зародышевых клетках их отца. Кроме

того, около 14% матерей, не являющихся носителями мутации,

могут быть соматическими или гонадными мозаиками, так что

вероятность повторного рождения больного ребенка у них также

повышена.

Около 10% всех идентифицированных мутаций в гене F8 яв-

ляются делециями одного или нескольких смежных экзонов. При-

мерно 5% всех мутаций составляют короткие делеции и дуплика-

ции гена, остальные мутации - точковые замены (Antonarakis

et al.,1995). Почти половина миссенс мутаций идентифицирова-

на в домене A2. Показано, что 35% всех известных мутаций ло-

кализовано в CpG динуклеотидах, причем свыше 90% из них

представляют собой C-T или G-A транзиции (Cooper,

Youssoufian, 1988). Подобные мутации в кодирующих районах

встречаются в 42 раза чаще, чем это можно было бы ожидать на

основании случайного характера мутагенеза. Для подавляющего

большинства мутаций гена F8C характерно практически полное

отсутствие "горячих" точек: каждая семья высокого риска по

гемофилии А имеет свою собственную мутацию. Исключение

составляет группа обнаруженных сравнительно недавно протя-

женных инверсий интрона 22, захватывающих экзоны 1-22 и пол-

ностью блокирующих функцию гена. Такие инверсии, как оказа-

лось, присутствуют в 45% семей с тяжелой формой гемофилии А

(Lakich et a.,1993). Причиной инверсий в этой области гена

является гомологичная рекомбинация между идентичными после-

довательностями гена F8А, расположенного в интроне 22

F8C-гена, и другими копиями этого же гена,находящимися на

расстоянии 500 кб от 5'конца гена F8 (см.выше).

Помимо инверсий и точечных мутаций в гене ФVIII заре-

гистрированы несколько случаев инсерционного мутагенеза,

связанных с перемещением в геноме транспазонподобных элемен-

тов типа LINE ( см. Главу II). У двух пациентов неродствен-

ного происхождения был идентифицирован инсертированный в эк-

зоне 14 F8C-гена длинный элемент LINE-1 (L1) (Kazazian et

al.,1988). В обеих семьях это были мутации de novo. L1

последовательности представляют собой специфическое для ге-

нома человека семейство длинных, размером от 2 до 4 кб, пов-

торяющихся элементов, распределенных по всем хромосомам и

состоящее, примерно, из 100 000 копий. Было показано что оба

L1 элемента, инсертированные в F8C-ген, родственны ретрот-

ранспозону, локализованному на хромосоме 22 (Dombroski et

al., 1991). В третьей семье инсертированный в интроне 10

F8C-гена L1 элемент не был связан с болезнью. Все 3 L1 эле-

мента имели открытые рамки считывания, а соответствующие ре-

конструируемые аминокислотные последовательности были высоко

идентичны друг другу с уровнем гомологии, превышающим 98%.

Таким образом, были получены еще одни косвенные подтвержде-

ния существования ряда функциональных L1 элементов, кодирую-

щих 1 или несколько белков, необходимых для их ретротранспо-

зиции.

Прямая диагностика протяженных инверсий в гене F8 осу-

ществляется путем блот-гибридизации с ДНК зондом р482.6 c

последующей рестрикцией эндонуклеазами Bcl1, Dra1, Nco1

(Lakich et al.,1993). В остальных случаях, в силу отсутствия

мажорных мутаций в гене F8C, чаще всего используют косвенные

методы молекулярной диагностики. С помощью ПЦР анализируют

полиморфные динуклеотидные СА-повторы экзона 13, HindIII по-

лиморфизм в интроне 19; HbaI полиморфизм в интроне 22 и вне-

генный полиморфизм локуса DXS52 (St14/TaqI) (Асеев и др.,

1989; Aseev et al., 1994; Сурин и др., 1990).

Учитывая наличие функционально активной формы белка

фактора VIII в плазме крови генноинженерые подходы в терапии

этого заболевания направлены на получение в чистом виде пол-

ноценного белкового продукта (заместительная терапия), либо

на введение в организм больного соответствующей кДНК,

обеспечивающей синтез ФVIII и его поступление в кровь. Осу-

ществленное 10 лет назад выделение и клонирование кДНК этого

гена сделало реальным оба эти подхода. Имеются сообщения о

получении трансгенных животных (коз), в геном которых введен

ген фактора VIII. Они могут быть использованы как продуценты

полноценного белкового продукта. Генная терапия этого забо-

левания находится на стадии экспериментальных разработок

(см.Главу IX). Успешно осуществлена трансдукция фибробластов

человека in vitro с помощью ретровирусного вектора. Основная

проблема в данном направлении заключается в выборе эффектив-

ного промотора и подборе клеток, в которых экспрессия гена

могла быть достаточно длительной. В настоящее время найдены

невирусные промоторы, обеспечивающие эффективную и длитель-

ную экспрессию гена фактора VIII in vivo. В качестве возмож-

ных клеток-мишеней используют мышечные клетки, фибробласты,

гепатоциты и клетки эндотелия сосудов. В 1994г. методом нап-

равленного мутагенеза (см.Главу VIII) получены трансгенные

модели гемофилии А на мышах. Есть все основания считать, что

клинические испытания генокоррекции этого заболевания нач-

нутся уже в ближайшем будущем.

10.4.4 Гемофилия B.

Гемоофилия B - сцепленное с полом заболевание, вызван-

ное наследственным дефектом фактора IX - важного компонента

средней фазы внутреннего каскада свертывания крови. Белок

(фактор IX) - гликопротеин, состоит из 415 аминокислотных

остатков, объединенных в 8 доменов, синтезируется в виде мо-

лекулы-предшественника клетками печени. В плазме крови фак-

тор IX находится в виде гетеродимера, состоящего из 2-х по-

липептидных цепей - легкой (L) и тяжелой (H), ковалентно

связанных между собой одним дисульфидным мостиком. Фактор IX

циркулирует в виде неактивного зимогена до тех пор, пока не

произойдет протеолитическое высвобождение его активирующего

пептида, что позволяет ему принять конформацию активной се-

риновой протеазы. Его роль в свертывании крови связана с ак-

тивацией фактора X посредством взаимодействий с ионами каль-

ция, фосфолипидами мембраны и фактором VIII.

Ген фактора IX транскрибируется в гепатоцитах с образо-

ванием мРНК размером 1 383 п.о. Для гена F9 характерна высо-

кая частота возникновения мутаций - 4.1*10!6 за поколение.

Также как и при гемофилии A мутации значительно чаще возни-

кают в сперматогенезе, чем в оогенезе (Montandon et

al.,1992). Считается, что вероятность получения мутации от

отца в 11 раз выше, чем от матери. Это означает, что в изо-

лированном случае вероятность гетерозиготного носительства

мутации у матери составвляет более 80%. Обнаружена четкая

корреляция между возрастом отца и вероятностью получения от

него новой мутации в гене F9. Так, средний возраст отца в

момент рождения дочери - носительницы новой мутации, состав-

ляет около 42 лет (King et al.,1992).

К 1994 г идентифицировано около 400 мутаций в гене ге-

мофилии B. Подавляющее большинство из них замены нуклеоти-

дов, приводящие к заменам аминокислот или к образованию

стоп-кодонов. Характерно, практически, полное отсутствие вы-

раженных мажорных мутаций и доминирующих областей повышенной

частоты мутирования. Только одна мутация - I397T, встрети-

лась в 7 самьях. Около 42% точечных мутаций возникает в CpG

динуклеотидах (Bottema et al., 1993). Показано, что частота

G-A или C-T транзиций в CpG cайтах в 24 раза выше, чем в

других местах гена (Koeberl et al., 1990). Кроме того, в CpG

динуклеотидах гена F9 в 7.7 раз чаще возникают трансверсии

(A-T, A-C, G-T или G-C). Это обьясняется тем, что содержание

(G+C) в кодирующих областях F9-гена составляет 40% (Bottema

et al., 1991).

В 40% случаев при тяжелых, ингибиторных формах гемофи-

лии В у пациентов обнаруживаются делеции различной протяжен-

ности. Около 10% точковых мутаций локализовано в донорных или

акцепторных сайтах сплайсинга или создают новые сайты

сплайсинга внутри интронов. В одной семье разрушение гена

произошло в результате инсерции Alu-элемента в экзон 5

(Vidaud et al., 1993). Описано 13 точковых мутаций в промо-

торной области гена F9. Именно с такими мутациями связана

Лейденовская (Leyden) форма заболевания, при которой к воз-

расту половозрелости наступает улучшение многих клинических

показателей и, в частности, исчезает кровоточащий диатез.

Обьясняется это тем, что мутации в промоторной области могут

приводить к переключению конститутивной экспрессии гена на

стероид-гармон-зависимую, нарушая связывание гепатоцитарного

ядерного фактора 4 (HNF-4), принадлежащего к суперсемейству

транскрипционных факторов для рецепторов стероидных гормонов.

Гемофилия B была использована как модель для выработки

стратегии генетического консультирования при моногенных за-

болеваниях, обладающих выраженной мутационной гетероген-

ностью (Giannelli et al., 1992). Основой такой стратегии яв-

ляется составление национальных баз данных молекулярных де-

фектов и специфических методов их диагностики. В частности,

основываясь на подобной информации, авторы провели характе-

ристику мутаций в группе из 170 неродственных индивидуумов с

гемофилией B шведского и английского происхождения и только

в одном случае им не удалось идентифицировать мутацию.

Молекулярная диагностика гемофилии В проводится как

непрямыми так и прямыми методами. Непрямая диагностика осно-

вана на анализе методом ПЦР внутригенных полиморфных сайтов:

Taq1 (в положении 11 109-11 113); инсерционного полиморфизма

в интроне А (рестриктазы Hinf1 и Dde1) ; Taq1 в интроне F в

положении 72. Метод ПДРФ анализа информативен только у

60-70% всех семей с гемофилией В (Aseev et al., 1994; Сурин

и др., 1994). Прямая диагностика гемофилии В включает ампли-

фикацию геномных фрагментов гена фактора IX с последующей

детекцией ошибок комплементации методом mismatch detection

(см.Главу IV) и прямое секвенирование продуктов амплификации

(Montadont et al.1990).

Сравнительно небольшие размеры гена, присутствие белко-

вого генопродукта в сыворотке крови и наличие естественных

биологических моделей способствовали быстрому прогрессу

исследований по генотерапия гемофилии В, которая в настоящее

время уже включена в программы клинических испытаний. Успеш-

ная трансдукция и коррекция генетического дефекта получена в

опытах in vitro и in vivo на самых различных модельных

системах (Culver, 1994; Gerrard et al., 1993). Так, при вве-

дении полноразмерной кДНК в составе ретровирусного вектора в

первичные культуры кератиноцитов человека наблюдали

экспрессию F9 и секрецию биологически активного фактора IX.

После трансплантации этих трансдуцированных клеток nu/nu мы-

шам человеческий фактор IX в небольшом количестве появлялся

в кроветоке и сохранялся там в течение недели (Gerrard et

al.,1993). На собаках, страдающих гемофилией B, осуществлена

трансдукция гепатоцитов in vivo путем прямой инфузии реком-

бинантного ретровирусного вектора в портальную вену. При

этом наблюдали устойчивую экспрессию фактора IX в течение

более 5 месяцев и улучшение биохимических показателей свер-

тываемости крови (Kay et al.,1993). Имеется сообщение об

успешной коррекции гемофилии В в Китае в 1992г. Двум больным

мальчикам в кожу спины трансплантировали культуру аутологич-

ных фибробластов, предварительно трансдуцированных ex vivo

рекомбинантной кДНК гена FVIII. Несмотря на определенный

скептицизм в оценке этого достижения со стороны специа-

листов, нет сомнения в том, что успешная генотерапия гемофи-

лии В - событие самого ближайшего будущего.

10.4.5 Болезнь Виллебранда.

Болезнь Виллебранда- аутосомно-доминантное (при некото-

рых формах рецессивное) заболевание, обусловленное

наследственным дефицитом белка VIIIR, родственного фактору

VIIIС свертывания крови (см.Гемофилия А) и известного, как

фактор фон Виллебранда. Этот большой гликопротеин синтезиру-

ется клетками эндотелия, в которых специфическая YIIIR-мРНК

составляет 0.3%, и поступает в кровь в виде двух мультимеров

с молекулярными весами от 850 кД до 20 миллионов дальтон.

Фактор VIIIR осуществляет взаимодействие между стенкой сосу-

дов и тромбоцитами, регулируя их адгезию в местах поврежде-

ния эндотелия. Фактор VIIIR участвует также в регуляции син-

теза и секреции фактора YIIIC и стабилизирует комплекс фак-

тора VIII.

Различают 7 типов болезни Виллебранда - I, IIA-IIE и

III (Zimmerman, Ruggeri, 1987). При типе I снижена концент-

рация всех мультимеров в плазме, но их качество не нарушено.

Генетически эта форма заболевания подразделяется на ре-

цессивные и доминантные варианты. Типы IIC и III - рецессив-

ны. Тип II характеризуется качественными аномалиями фактора

VIIIR, выражающимися в уменьшении способности формировать

большие мультимеры, (типы IIA и IIC) или в увеличении ско-

рости их выведения из плазмы (тип IIB).

Ген F8VWF достаточно протяженный и состоит из 52 экзонов,

размерами от 40 до 1379 п.о. (Mancuso et al., 1989). Величи-

на интронов варьирует в огромных пределах (от 100 до 20 000

пар нуклеотидов). Сигнальный пептид и пропептид кодируются

первыми 17 экзонами, в то время как зрелая субьединица

VIIIR- фактора и 3'нетранслируемая область - остальными 35

экзонами. Внутри гена идентифицированы повторяющиеся после-

довательности, включая 14 Alu-элементов и полиморфный TCTA

повтор размером около 670 п.о. в интроне 40. Районы гены,

кодирующие гомологичные домены, имеют сходную структуру. На

хромосоме 22q11-q13 обнаружен псевдоген длиной 21-29 кб,

соответствующий экзонам 23-34 F8VWF-гена (Mancuso et al.,

1991). Идентифицированные в нем сплайсинговые и нонсенс му-

тации препятствуют образованию функционального транскрипта.

Наибольшее число мутаций идентифицировано при типе II

болезни Виллебранда. Подавляющее большинство из них - замены

аминокислот, чаще всего происходящие в результате транзиций

в CpG динуклеотидах (Cooney et al., 1991; Randi et al.,

1991; Donner et al., 1992). Мутации при болезни типа IIA

кластерированы в A2 домене, где предположительно локализован

сайт протеолетического отщепления, в то время, как при типе

IIB - в домене, обеспечивающим взаимодействие с тромбоцитар-

ным гликопротеиновым комплексом (Ib-IX рецептором). Большая

группа мутаций при форме заболевания IIB локализована в сег-

менте из 11 аминокислот внутри единственного дисульфидного

изгиба (loop), соединяющего цистеины в 509 и 695 положениях.

При форме заболевания Нормандского типа, мимикриющей гемофи-

лию A, фактор Виллебранда структурно и функционально норма-

лен, за исключеним того, что нарушено его взаимодействие с

фактором YIII. У таких пациентов действительно идентифициру-

ются миссенс мутации, расположенные в области гена, кодирую-

щей сайты связывания фактора VIIIR с фактором VIIIС

(Mazurier, 1992).

Тип III представляет собой наиболее тяжелую форму забо-

левания, при которй фактор VIIIR, как правило, отсутствует.

Получены доказательства, что такие пациенты являются гомози-

готами или компаундами по нонсенс мутациям, обнаруживаемым в

одной дозе у больных типа I (Zhang et al., 1992). При этом

же типе заболевания выявлен кластер мутаций со сдвигом рамки

считывания, возникаюших в результате делеции одного из 6 ци-

тозинов в положении 2679-2684 экзона 18. Именно такая мута-

ция была обнаружена в семье, зарегистрированной впервые фон

Виллебрандом в 1926 году. У некоторых членов этой родослов-

ной как было установлено недавно, она находилась в компаунде

с мутацией P1266L, возникшей в результате рекомбинации между

геном F8VWF и псевдогеном (см. выше) (Zhang et al., 1993).

Выбор адекватного метода молекулярной диагностики бо-

лезни Виллебранда в значительной мере предопределяется пра-

вильностью предшествующей клинической и лабораторной диаг-

ностики и результатами медико-генетического консультирова-

ния, позволяющей достаточно четко определить характер насле-

дования заболевания в семье высокого риска и установить его

форму. К сожалению, достичь этого далеко не всегда возможно,

а отсутствие характерных мажорных мутаций значительно снижа-

ет эффективность прямой молекулярной диагностики. Вместе с

тем, по крайней мере, в некоторых популяций (Финляндия, Шве-

ция) обнаружены "горячие" точки мутаций, которыми являются

экзоны 18 и 42, при типе II болезни Виллебранда (Holmberg et

al,1993). В популяциях России такие "горячие " точки пока не

обнаружены, хотя исследования в этом направлении ведутся

(Асеев, Шауи Абдельрхани, 1995). Значительно более перспек-

тивной на современном этапе представляется непрямая диаг-

ностика. В промоторной части гена, в интронах

15, 17, 23, 40, 41, 49, а также в экзонах 26, 35, 39 иденти-

фицированы многочисленные полиморфные сайты рестрикции с

достаточно высоким уровнем полиморфизма. Особенно перспек-

тивным для диагностики является полиморфизм интрона

40, представляющий собой две области варьирующих по числу

тетрамерных повторов ТСТА на расстоянии 212 п.о. Амплифика-

ция этой части интрона 4О с помощью ПЦР, рестрикция AluI с

последующим электрофоретическим разделением позволяет иден-

тифицировать до 98 аллельных вариантов этого полиморфизма

(Mercter et al.,1991). Столь выраженный полиморфизм позволя-

ет с высокой эффективностью маркировать мутантную хромосому

(ген) и проследить её передачу в потомстве.

Сведения о генокоррекции болезни Виллебранда в доступ-

ной литературе не обнаружены.

10.4.6 Фенилкетонурия.

Фенилкетонурия (ФКУ) - одно из наиболее частых аутосом-

но-рецессивных заболеваний, обусловленных наследственным де-

фектом фенилаланингидроксилазы, приводящим при отсутствии

своевременной терапии к тяжелой умственной отсталости. В Ев-

ропе один больной ребенок встречается в среднем среди 10 -

17 000 новорожденных. В Ирландии и Шотландии частота ФКУ

достигает 1 на 4500 новоржденных (DiLella et al., 1986).

Распространена ФКУ также в Польше и в Белоруссии. В России

частота заболевания колеблется в пределах 1 : 8 - 10 000.

Очень важна ранняя диагностика ФКУ, так как при своевремен-

ном назначении пациенту диеты, не содержащей фенилаланин,

умственная ограниченность, как правило, не развивается или

имеет очень стертые формы. Разработаны биохимические скрини-

рующие тесты диагностики ФКУ у новорожденных.

Гидроксилирование фенилаланина является достаточно

сложным процессом, в котором участвуют, по крайней мере, 3

фермента. Фенилаланингидроксилаза (РАН), гомополимерный фер-

мент, состоящий из субъединиц с молекулярным весом 52 кД,

продуцируется клетками печени и регулирует превращение L-фе-

нилаланина в L-тирозин. Его дефицит приводит к накоплению

фенилаланина в сыворотке крови. Гиперфенилаланинемия может

возникать также при дефиците дигидроптеридинредуктазы и при

дефектах синтеза биоптерина. Однако, эти заболевания, хотя и

сопровождаются снижением активности РАН, значительно отлича-

ются от классической ФКУ и не коррегируются диетой, лишенной

фенилаланина.

PAH-ген транскрибируется в гепатоцитах с образованием

мРНК размером 2.4 кб. Наиболее распространенный тип мутаций

- однонуклеотдные замены (миссенс, нонсенс, мутации в сайтах

сплайсинга), причем часто эти мутации являются результатом

транзиций в 22-х обнаруженных в PAH-гене CpG динуклеотидах.

Крупных структурных перестроек не найдено, хотя имеется не-

большой процент точечных делеций. Отмечается неравномерный

характер внутригенной локализации мутаций (Scriver et

al.,1989). Так, наибольшее число миссенс мутаций встречается

в центральной части гена: в экзоне 7, кодирующем участок

связывания белка с кофактором, где располжено 5 CpG дупле-

тов, а также в экзонах 9 и 12. Преимущественный район лока-

лизации делеций - экзоны 1, 2 и 3.

Втури РАН-гена локализованоно более 10 полиморфных сай-

тов рестрикции, причем распределения гаплотипов по этим мар-

керам среди представителей разных рас и этнических групп

значительно различаются. Обнаружено сильное неравновесие по

сцеплению между определенными мутациями в PAH-гене и гапло-

типами по внутригенным сайтам рестрикции. Так, каждая из 5-и

наиболее частых в европейских популяциях мутаций ассоцииро-

вана только с одним из более, чем 70 гаплотипов по 8 рест-

рикционным полиморфизмам (Eisensmith et al., 1992). Мажорная

в западно-европейских популяциях сплайсинговая мутация в до-

норном сайте 12-го интрона сцеплена с гаплотипом 3 (DiLella

et al.,1986). В то же время другая мутация в экзоне 12 -

R408W, наиболее распространенная на востоке Европы, в част-

ности в Белоруссии и России, и не найденная в Японии и Ки-

тае, связана с гаплотипом 2 (DiLella et al.,1987). Мажорная в

Европе мутация R158Q в 40% сцеплена с гаплотипом 4, наиболее

частым среди жителей Японии и Китая. Распространенная в Тур-

ции сплайсинговая мутация в интроне 10, приводящая к

9-и-нуклеотидной инсерции, ассоциирована с "южными" гаплоти-

пами 6, 10 и 36.

Сопоставление частот различных гаплотипов по полиморф-

ным сайтам рестрикции и мутаций в PAH-гене в разных популя-

циях, национальностях и этнических группах позволяет сделать

вывод , что большинство из них, или даже все, произошли уже

после дивергенции рас. Распространение мажорных мутаций гена

РАН в различных популяциях и этнических группах связано с

эффектом основателя. По некоторым оценкам эти мутации воз-

никли однократно от нескольких сотен до нескольких тысяч лет

тому назад. Однако, в ряде случаев распределение мутаций не

может быть обьяснено в генетических терминах, сопоставимых с

демографической историей. Несомненно доказанными являются

примеры независимого и рекуррентного возникновения в разных

популяциях таких мутаций, как R261Q или R158Q. Высокие попу-

ляционные частоты специфических мутаций в PAH-гене связаны,

по-видимому, не только с эффектом основателя и/или с сущест-

вованием эндогенных механизмов повышенного мутагенеза, но и

с преимуществом гетерозигот. Высказано предположение, что

носительство РАН - мутаций повышает устойчивость организма к

токсическому эффекту охратоксина А, продуцируемого некоторы-

ми видами грибковой плесени (Aspergillus, Penicillium), раз-

вивающимися при хранении зерна и других продуктов

(Woolf,1986). Предполагается, что беременные женщины, гете-

розиготные пл РАН -мутациям имеют меньшую вероятность абор-

та, индуцированного действием этих микотоксинов. Возможно,

высокая частота ФКУ в Ирландии и Шотландии частично может

быть обьяснена мягким и влажным климатом этих стран,

способствующем росту таких грибов.

В медицинской практике используется как прямая, так и

косвенная диагностика мутаций в PAH-гене. Разработан очень

быстрый и эффективный метод ПЦР/StyI-диагностики cамой

частой в России (более 70%) мутации R408W (Ivaschenko,

Baranov, 1993; Иващенко и др., 1993). Дигностика других ма-

жорных мутаций в PAH-гене осуществляется методами ПЦР+АСО,

аллель-специфической амплификации (ARMS), методом одноните-

вого конформационного полиморфизма (SSCP) (см. Главу IY).

При первичном обследовании семьи черезвычайно удобно исполь-

зовать три полиморфные нейтральные мутации в кодонах 232,

245 и 385, сцепленные в Кавказских популяциях с определенны-

ми ПДРФ-гаплотипами, а значит и со специфическими мутантными

аллелями. Каждая из этих мутаций создает новый сайт рестрик-

ции и поэтому их аллельное состояние может быть легко проти-

пировано с помощью амплификации и рестрикции (Kalaydjieva et

al., 1991). При анализе семьи, в которой отсутствуют легко

идентифицируемые прямыми методами мутации, молекулярная ди-

агностика может быть проведена с помощью внутригенных поли-

морфных сайтов рестрикции. Удобен, в частности, Msp1-поли-

морфизм в 8-м экзоне, анализ которого может быть осуществлен

методом ПЦР/рестрикции (Wedmeyer et al., 1993). В последнее

время появились даные о наличии высокополиморфных сайтов

внутри интронов гена РАН, которые оказались особенно удобны-

ми для молекулярного маркирования мутантных аллелей (Goltzov

et al.1994).

Генокоррекция ФКУ успешно осуществлена в опытах in

vitro и в настоящее время находится на стадии эксперимен-

тальной разработки (Табл.9.2. Глава IX).

10.4.7 Синдром Леш-Нихана.

Синдром Леш-Нихана - рецессивное сцепленное с полом за-

болевание, обусловленное наследственной недостаточностью ги-

поксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы (HPRT) и сопровож-

дающееся тяжелыми поражениями центральной нервной системы.

Фермент HPRT участвует в регуляции метаболизма пуринов,

контролируя превращение гуанина и инозина в соответствующие

рибонуклеотиды. Ген HPRT экспрессируется во всех типах кле-

ток с образованием мРНК размером 654 п.о.. Культивируемые

линии клеток, дефектные по HPRT, устойчивы к 8-азагуанину и

6-тиогуанину, и таким образом, могут быть отобраны на соот-

ветствующих селективных средах. Гетерозиготные носители му-

таций по HPRT-гену могут быть легко выявлены по наличию 2-х

типов клеток - устойчивых и чувствительных к 8-азагуанину, в

первичной культуре фибробластов или в клетках волосяных лу-

ковиц. В большинстве мутантных клеточных линий количество

мРНК нормально, а белок отсутствует. У части пациентов хотя

и транскрибируется достаточно много мРНК, но в этих молеку-

лах обнаруживаются структурные и функциональные аномалии. В

небольшом проценте случаев у больных не удается выявить ни

белка, ни мРНК.

В 15% хромосом у больных с синдромом Леш Нихана ген

HPRT вовлечен в крупные структурные перестройки, корторые

могут быть выявлены методами Саузерн или Нозерн блот-гибри-

дизации. Синдром Леш Нихана одно из первых моногенных

наследственных заболеваний, для которых была проведена моле-

кулярная идентификация точечных мутантных аллелей. Именно на

этой моделе впервые был разработан и опробован метод анализа

мутаций, основанный на расщеплении РНК-ДНК гибридов рибонук-

леазой А в местах негомологичноно спаривания (метод расщеп-

ления рибонуклеазой А - см.Главу VI, Gibbs, Caskey, 1987).

Комбинация методов блот-гибридизации и расщепления рибонук-

леазой А позволяет выявить до 50% мутаций. В настоящее время

в гене HPRT найдено более 100 спорадических мутаций, полови-

на которых - однонуклеотидные замены типа миссенс, нонсенс и

в сайтах сплайсинга. Около 40% мутантных хромосом имеют

структурные аномалии, в том числе крупные делеции, нехватки

отдельных зкзонов и микроделеции одного или нескольких нук-

леотидов. В HPRT-гене, практически, отсутствуют мутации, до-

мининирующие по частоте в каких-либо популяциях. Исключение

составляет нонсенс мутация R170TER, которая составляет около

15% всех нуклеотидных замен (Gibbs et al., 1989). Также как

и при гемофилиях мутации гена HPRT чаще возникают в сперма-

тогенезе, чем в оогенезе. Вероятность мутирования возрастает

с возрастом отца. Идентифицировано 3 HPRT-псевдогена в хро-

мосомах 3, 5 и 11 (Stout, Caskey, 1984).

Описаны редкие случаи синдрома Леш Нихана у гетерози-

готных девочек. При этом, как правило, болезнь развивается

вследствие неслучайной инактивации X-хромосомы, не содержа-

щей мутации (Ogasawara et al., 1989). Однако, у 3-х женщин -

облигатных носительниц мутаций в HPRT-гене, селективный тест

не выявил присутствия мутантных клеток в культивируемых фиб-

робластах и волосяных луковицах. В связи с этим высказано

предположение, что определенные мутации гена HPRT находятся

в неравновесном сцеплении с неидентифицированной летальной

мутацией в X-хромосоме, что и приводит к селекции клона кле-

ток только с одной (мутантной или немутантной по гену HPRT)

X-хромосомой (Marcus et al., 1992).

Молекулярная диагностика болезни Леш-Нихана возможна

прямыми и непрямыми методами. Прямой вариант основан на про-

ведении обратной транскрипции мРНК, ее амплификации,

SSCP-анализе одноцепочечных ДНК фрагментов с их последующим

секвенированием (см.Глава VI). Косвенная диагностика пре-

дусматривает маркирование мутантной хромосомы при помощи по-

лиморфных сайтов (в частности, локуса DXS52 - зонд

St14/TaqI).

Как мы уже отмечали (Главы VII,VIII), первая трансген-

ная животная модель наследственного заболевания человека,

сконструированная путем направленного переноса мутациий в

культивируемые эмбриональные стволовые клетки, была получена

для синдрома Леш-Нихана (Hooper et al., 1987; Kuehn et al.,

1987). На этой моделе впервые была проведена генокоррекция

наследственного дефекта in vivo. Эти успехи в значительной

степени связаны с существованием селективных сред, позволяю-

щих вести автоматический отбор мутантных клеток. Вообще,

синдром Леш-Нихана представляет собой идеальную систему не

только для изучения пуринового метаболизма, но и для решения

многих теоретических вопросов биологии и медицины

(Seegmiller, 1989; Maraus et al., 1993; Boyel et al., 1993).

Сложность генокоррекции заболевания, однако, заключается в

необходимости обеспечения эффективной доставки гена HPRT

(или его кДНК) непосредственно в мутантные нервные клет-

ки. Эта проблема еще не решена. Поэтому реальные клинические

программы генотерапии этого заболевания на сегоднешний день

отсутствуют (см.Главу IX).

10.4.8 Болезнь Вильсона-Коновалова.

Болезнь Вильсона-Коновалова (БВК) - гепатолентикулярная

дегенерация - аутосомно-рецессивное заболевание, обусловлен-

ное наследственным дефектом одной из медь-транспортирующих

АТФаз. У больных резко снижена концентрация основного

медь-содержащего белка плазмы крови - церулоплазмина и в

меньшей степени - цитохромоксидазы, еще одного белка, участ-

вующего в метаболизме меди. Выделяют, по крайней мере, 3

формы БВК (Cox et al. , 1972). При редкой атипичной форме,

предположительно Германского происхождения, у гетерозигот

содержание церулоплазмина снижено, по крайней мере, в два

раза. При двух других, типичных формах - славянской и юве-

нильной, содержание церулоплазмина у гетерозигот находится в

пределах нормы. Славянский тип БВК характеризуется сравни-

тельно поздним началом и преимущественно неврологической

симптоматикой. Ювенильная форма чаще встречается в Западной

Европе и ведущими в этиологии заболевания являются печеноч-

ные нарушения. Среди евреев-ашкенази встречается БВК с позд-

ним началом и почти нормальным содержанием церулоплазмина в

сыворотке крови больных.

Ген БВК, идентифицированный в 1993г. независимо сразу в

2х лабораториях США, представляет собой медь-транспортирую-

щую АТФазу P типа с 6-ю металл-связывающими районами. Ген

имеет 60% гомологию по нуклеотидному составу с ранее иденти-

фицированным геном АТФ-азы (АТР7А), мутантном при болезни

Менкеса (Bull et al., 1993; Petruchin et al., 1993; Tanzi et

al., 1993). По аналогии с геном болезни Менкеса, также

обусловленной нарушением транспорта меди, ген БВК назван

АТР7В. Два пациента с БВК оказались гомозиготными по 7-нукле-

отидной делеции в кодирующей области гена ATP7B , что дока-

зывало его идентичность гену БВК (Petruchin et al, 1993).

Ген экспрессируется в клетках печени, мозга, почках, лимфо-

узлах. Типичным для экспрессии АТР7В оказался альтернативный

сплайсинг двух и более экзонов центральной части гена

(6, 7, 8, 12 и 13).

Кодируемый ATP7B-геном белок содержит несколько мемб-

ранных доменов, АТФ-консенсусную последовательность, сайт

фосфорилирования и, по крайней мере, 2 медь-связывающих сай-

та. В мозге, печени, почках и ломфоузлах обнаружены изоформы

белка, соответствующие продуктам альтернативного сплайсинга

гена АТР7В. Их назначение и функции пока неизвесты. В гене

АТР7В идентифицированы полиморфные микросателлитные маркеры,

а также около 10 полиморфных сайтов рестрикции. В настоящее

время в гене АТР7В идентифицированы более 30 мутаций, в том

числе 14 мелких делеций/инсерций, 2 - нонсенс мутации, 15 -

миссенс мутаций, 3 - сплайсинговые мутации. Диагностическую

ценность для европейцев представляют мутации His1070Gln и

Gly1267Lys, зарегистрованные в 28% и 10% всех мутантных хро-

мосом, соответственно (Thomas et al., 1995).

В заключении данного раздела представляется целесооб-

разным кратко рассмотреть другие достаточно частые моноген-

ные заболевания, для которых показана и проводится молеку-

лярная диагностика, в том числе и пренатальная, в других ме-

дико-генетических центрах России и, прежде всего, в Лабора-

тории молекулярной диагностики Институтата клинической гене-

тики РАМН (Москва).

10.4.9 Адрено-генитальный синдром.

Адрено-генитальный синдром - (врожденный дефицит

21-гидроксилазы) - достаточно распространенное аутосомно-ре-

цессивное заболевание. Частота "классических" форм 1:10 000

новоржденных, "неклассической" - около 1% в популяции. В за-

висимости от характера нарушения функции гена и, соот-

ветственно клинических проявлений "классическая форма" под-

разделляется на два варианта: 1. летальная сольтеряющая фор-

ма; 2. нелетальная - вирилизирующая форма, связанная c из-

бытком андрогенов (Morel, Miller, 1991).

В локусе 6р21.3, внутри сложного супергенетического

комплекса HLA идентифицированы два тандемно расположенных

21-гидроксилазных гена - функционально активный CYP21B и

псвдоген - CYP21А, неактивный вследствие делеции в 3-м экзо-

не, инсерции со сдвигом рамки считывания в 7-м экзоне и

нонсенс мутаций - в 8-м экзоне. Ген и псевдоген разделены

смысловой последовательностью гена С4В, кодирующей 4-й фак-

тор комплемента. Оба гена состоят из 10 экзонов, имеют длину

3,4 кб и отличаются только по 87 нуклеотидам. Высокая сте-

пень гомологии и тандемное расположение указвают на общность

эволюционного происхождения этих генов. Любопытно отметить,

что такие же тандемно расположенные гены 21-гидроксилазы

(называемые также Р450с21) обнаружены и у других млекопитаю-

щих, причем у мышей, в отличие от человека, активен только

ген CYP21A, но не CYP21B, тогда как у крупного рогатого ско-

та функционально активны оба гена.

Белок- 21-гидроксилаза ( Р450с21- микросомальный цитох-

ром 450) обеспечивает превращение 17-гидроксипрогестерона в

11-дезоксикортизол и прогестерона - в дезоксикортикостерон.

В первом случае возникает дефицит глюкокортикоидов и, прежде

всего, кортизола, что в свою очередь стимулирует синтез

АКТГ, и ведет к гиперплазии коры надпочечников (вирилирующая

форма). Нарушение превращения прогестерона в дезоксипрогесте-

рон ведет к дефициту альдостерона, что в свою очередь нару-

шает способность почек удерживать ионы натрия и приводит к

быстрой потере соли плазмой крови (соль теряющая форма).

Как и в случае гемофилии А, наличие рядом с кодирующим

геном гомологичной ДНК последовательности зачастую ведет к

нарушениям спаривания в мейозе и, как следствие этого, к

конверсии генов (перемещения фрагмента активного гена на

псевдоген), либо к делеции части смыслового гена. В обоих

случаях функция активного гена нарушается. На долю делеций

приходится около 40% мутаций, на долю конверсий - 20% и при-

мерно 25% составляют точечные мутации. Согласно отечествен-

ным данным в случае наиболее тяжелой сольтеряющей формы АГС,

на долю конверсий приходится более 20% мутантных хромосом,

на долю делеций - около 10% (Evgrafov et al., 1995).

Непрямая диагностика АГС возможна с помощью типирования

тесно сцепленных с геном CYP21B аллелей HLA A и HLA B генов,

а также алелей гена HLA DQA1. Прямая ДНК диагностика АГС

основана на амплификакции с помощью ПЦР отдельных фрагментов

генов CYP21B и CYP21A, их рестрикции эндонуклеазами HaeIII

или RsaI и анализе полученных фрагментов после электрофореза

(Evgrafov et al., 1995).

10.4.10 Спинальная мышечная атрофия.

Спинальная мышечная атрофия (СМА) - аутосомно-рецессив-

ное заболевание, характеризуется поражением моторных нейро-

нов передних рогов спинного мозга, в результате чего разви-

ваются симметричные параличи конечностей и мышц туловища.

Это - второе после муковисцидоза наиболее частое летальное

моногенное заболевание (частота 1: 6 000 новорожденных).

СМА подразделяется на три клинические формы. Тип I. Острая

форма (болезнь Верднига-Гоффмана), проявляется в первые 6 ме-

сяцев жизни и приводит к смерти уже в первые два года; Тип

II. Средняя (промежуточная) форма, пациенты не могут стоять,

но обычно живут более 4-х лет; Тип III. Ювенильная форма

(болезнь Кугельберга-Веландера) - прогрессирующая мышечная

слабость после 2-х лет. Все три формы представляют собой ал-

лельные варианты мутаций одного гена SMN (survival motor

neurons), картированного в локусе D5S125 (5q13) и идентифи-

цированного методом позиционного клонирования (см.Главу III)

в 1995г (Lefebvre et al. 1995). В этой пока единственой ра-

боте показано, что ген SMN размером всего 20 000 п.о.состоит

из 8 экзонов. мРНК этого гена содержит 1 700 п.о. и кодирует

ранее неизвестный белок из 294 аминокислотных остатков с

молекулярным весом 32 КилоДальтона.

Ген дуплицирован. Его копия (возможно вариант псевдоге-

на) располагается несколько ближе к центромере и отличается

от гена SMN наличием 5-и точечных мутаций, позволяющих отли-

чить оба гена путем амплификации экзонов 7 и 8 и их исследо-

ванием методом SSCP анализа (см.Главу IV). Ген назван

сBCD541, по аналогии с первоначальным вариантом названия для

теломерной копии, т 4о 0е 4сть 0гена SMN, tBCD541. Ген cBCD541

экспрессируется, но в отличие от гена SMN его сДНК подверга-

ется альтернативному сплайсингу с утратой экзона 7.

Отсутствие гена SMN (tBCD541) у 93% больных (213 из 229),

его разорванная (interrupted) структура у 13 обследованных

пациентов (5.6%) и наличие серьезных мутаций у оставшихся

3-х больных дали основание именно данную теломерную копию

гена считать ответственной за заболевание. Существенно отме-

тить, что центромерная копия гена обнаружена у 95 4. 05% боль-

ных, 4тогд 0а 4как 0 отсутств 4ует она 0 только у 4,4% 4 пациентов 0.

В непосредственной близости от теломерного конца гена

SMN идентифицирован еще один ген - ген белка-ингибитора зап-

рогаммированной гибели нейронов (neuronal apoptosis

inhibitory protein -NAIP). При тяжелых клинических формах

СМА (Тип I), обусловленных делециями, по-видимому, нередко

происходит утрата гена NAIP.

Согласно гипотезе авторов СМА возникает при гомозигот-

ном состоянии мутаций (обычно-делеций) в гене SMN, 4при этом

различ 4ия между 0форм 4ами 0СМА определяются двумя основными фак-

торами: 1. числом копий гена cBCD541 (две - в случае Типа I

и четыре (возникающих вследствие конверсии между SMN и

cBCD541) - в случае Типа III), 2. наличием или отсутствием

ген 4а 0NAIP. 4С 0реди всех обследованных СМА-больных 4не

4обнаружены 0случа 4и одновременной 0делеции обоих гомологичных

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14