 |
РУБРИКИ |
: Литература - Другое (книга по генетике) |
РЕКОМЕНДУЕМ |
||
|
: Литература - Другое (книга по генетике)5) - при количестве мутаций, меньшем 5, все они указываются после знака ":", при большем количестве перечисляются только типы мутаций 96) - частоты заимствованы из сводной таблицы Scriver et al., 189. Сокращения - взр.- взрослые; дел.- делеция; дупл.- дуплика- ция; инс. - инсерция; н.- нуклеотиды; сплайс. - замена нуклеотидов в донорном или акцепторном сайтах сплайсинга или мутации в интронных об- ластях, создающие новый сайт сплайсинга; экз.- экзон Из таблицы 10.1 следует, что для 29 из 31 лизосомных болезней определена хромосомная локализация гена, причем в 26 случаях - абсолютно однозначно. 23 лизосомных гена клони- рованы. Для 20 лизосомных заболеваний описаны различные му- тантные аллели, что подтверждает правильность идентификация соответствующих генов (см.Главу III). Для 12 заболеваний на- йены мажорные мутации в различных популяциях. Для 8 заболе- ваний общее количество идентифицированных мутаций пока не превысило шести и, возможно, мажорные мутации для них еще будут идентифицированы. Спектр мутаций в разных лизосомных генах очень разнооб- разен. Так, при болезни Фабри наряду с явным преобладанием миссенс мутаций обнаружено 14 внутригенных перестроек разме- рами от 0.4 до 8 кб, многие из которых имеют точки разрыва в экзоне 2 - области локализации большого числа Alu-повторов. Сам ген GLA содержит 12 различных Alu-элементов, составляю- щих около 30% его длины. В местах разрывов часто обнаружива- ются короткие прямые и обращенные 2-6 нуклеотидные повторы. Одним из возможных механизмов возникновения структурных пе- рестроек в данном гене может быть незаконная Alu-Alu реком- бинация или, что более вероятно, рекомбинация между коротки- ми повторами. Участие Alu-элементов предполагается также при возникновении 16-кб делеции промоторной области и первых 5-и экзонов гена HEXB - мажорной мутации при болезни Зандхоффа. Нарушение процесса рекомбинации является, по-видимому, при- чиной возникновения очень большого числа крупных и мелких делеций в IDS-гене при синдроме Хантера. Высокая концентра- ция CpG динуклеотидов рассматривается как возможный эндоген- ный механизм возникновения мажорной среди евреев-ашкенази мутации P330FS в гене SPDM1 при болезни Ниманна-Пика типа B, так как эта делеция возникает в районе, где из 10 остатков 9 составляют цистеины. Делеции целых экзонов или инсерции интронных областей возникают сравнительно часто в результате точковых мутаций в донорных или акцепторных сайтах сплайсинга. Примерами являют- ся мажорная в Японии сплайсинговая мутация, сопровождающаяся делецией 7-го экзона гена- PPGB, приводящая к галактосиалидо- зу и сплайсинговая мутация IVS2+1, обусловливающая вырезание экзона 2 гена GBA при болезни Гоше. Появление в результате точковой мутации в интронной области нового сайта сплайсинга также может сопровождаться структурными перестройками. Тако- ва, в частности, природа 33-нуклеотидной инсерции в гене PSAP при метахроматической лейкодистрофии, обусловленной дефицитом SAP1; 24-кб инсерции в гене HEXB при болезни Зандхоффа и 5-нуклеотидной инсерции в гене IDUA при синдроме Шейе. Важно отметить, что подобные мутации совместимы с образованием не- большого числа функционально активных мРНК, следствием чего является относительно более мягкое течение соответствующих форм заболеваний. В некоторых случаях возникновению мутаций может способствовать наличие псевдогена. Молекулярный анализ псев- догена, тесно сцепленного с геном GBA, показал, что, по крайней мере, 4 мутации, обнаруженные у пациентов с болезнью Гоше, присутствуют в норме в псевдогене. Это 2 мажорные му- тации - L444P и IVS2+1 и еще 2 миссенс мутации в 10-м экзоне (A456P и V460V). Подобное сходство несомненно указывает на фундаментальную роль псевдогена в образовании мутаций в GBA-гене. В то же время само по себе присутствие псевдогена не является мутагенным фактором, особенно если сам ген и его псевдоген локализованы в разных хромосомах, как, например, в случае генов GM2A и FUCA1, псевдогены которых находятся в хромосоме 3 и в области 2q31-q32, соответственно. Для двух лизосомных болезней - фукозидоза и синдрома Гурлера, мажорными являются нонсенс мутации. Более того, при фукосидозе все известные к настоящему времени мутации приво- дят к полному отсутствию продукта FUCA1-гена. Так, наряду с мажорной мутацией Q351X, представленной в 20% хромосом у больных фукосидозом, описаны еще 4 нонсенс мутации и 4 деле- ции со сдвигом рамки считывания. При синдроме Гурлера две мажорные нонсенс мутации - W402X и Q70X, составляют около 50% всех известных мутантных аллелей гена IDUA. Кроме того, при этом заболевании зарегистрированы еще 4 минорные по частоте нонсенс мутации и 1 делеция со сдвигом рамки считы- вания. 3 миссенс мутации и интронная мутация, создающая до- полнителный сайт сплайсинга в гене IDUA, не приводят к пол- ному блоку синтеза идуронидазы и реализуются в виде синдрома Шейе. Уместно заметить, что оба заболевания - синдром Гурле- ра и синдром Шейе, являются классическим примером фенотипи- ческого разнообразия, обусловленного существованием аллель- ных серий (см.Главу IV). Такой спектр крайне тяжелых мутаций нельзя объяснить только повышенной частотой их возникнове- ния. Более вероятным представляется предположение о том, что кодируемые FUCA1- и IDUA-генами белки обнаруживают опреде- ленную устойчивость к небольшим повреждениям и сохраняют функциональную активность при определенных аминокислотных заменах, то есть миссенс аллели в этих генах проявляют себя как нейтральные мутации и не приводят к развитию заболева- ний. Хорошо известно, что распространение мутаций в популя- циях определяется не только, и не столько повышенной часто- той их возникновения, но многими другими популяционно-гене- тическими факторами и, в первую очередь, связано с эффектом основателя (см.Главу V). Типичным следствием эффекта основа- теля, как известно, является наличие различных мажорных по частоте мутаций одного и того же гена у пациентов разных изолятов и этнических групп. Подобная картина наблюдается, в частности, при ганглиозидозе GMI. Так, в Японии мажорными при этом заболевании являются миссенс мутации I51T и R201C, тогда как в Европе преобладают мутации R482H и W273L. Эффек- том основателя можно объяснить высокую частоту аспартилглю- козаминурии в Финляндии, так как в 98% случаев у пациентов финского происхождения заболевание обусловлено присутствием одной и той же миссенс мутации C163S, резко уменьшающей ак- тивность аспартилглюкозаминидазы. Интересно отметить, что эта мутация у больных находится в сильном неравновесном сцеплении с другой миссенс мутацией в AGA-гене - R161Q, яв- ляющейся, в свою очередь, редкой формой полиморфизма. Невоз- можно, однако, исключить возможность комбинированного влия- ния этих двух мутаций на фенотип. Яркие примеры этнических различий по частоте и спектру мажорных мутаций выявляются при анализе таких лизосомных бо- лезней накопления как болезнь Тея-Сакса, Ниманна-Пика и бо- лезнь Гоше. Прежде всего, эти заболевания особенно распрост- ранены среди евреев-ашкенази, среди которых они встречаются в десятки раз чаще, чем в других популяциях европейского или азиатского происхождения. Наличие специфических мажорных му- таций для всех трех заболеваний у 70 - 95% всех пациентов еврейского происхождения скорее всего нельзя обьяснить толь- ко эффектом основателя. Генетический дрейф, селективное пре- имущество гетерозигот, характер миграции, социальные и рели- гиозные особенности, обусловливающие ассортативность образо- вания супружеских пар - вот те факторы, которые, по всей ви- димости, лежат в основе этих различий. В этой связи инте- ресно отметить, что среди пациентов других национальностей мажорные мутации гомологичных генов, как правило, иные, чем у евреев-ашкенази. Так, болезнь Ниманна-Пика типа B часто встречается среди жителей стран, расположенных в западной части Северной Африки. Однако, в 80% случаев заболевание связано с делецией R608 в SMPD1-гене, которая не является мажорной среди евреев-ашкенази. На примере лизосомных болезней могут быть хорошо прослежены корреляции между типами мутаций и клиническими особенностями заболеваний. Выше уже упоминалось об аллельных вариантах гена IDUA, приводящих либо к синдрому Гурлера, ли- бо к синдрому Шейе. Разные миссенс мутации в гене NAGA при- водят к болезни Шиндлера или к болезни Канзаки (Табл. 10.1.). Важное значение для анализа молекулярных основ пато- генеза заболеваний имеют специфические мутации с поздней фе- нотипической манифестацией (так называемые взрослые формы). Такие мутации обнаружены в соответствующих генах при болез- нях Тея-Сакса и галактосиалидозе. Очень интересен случай различного фенотипического проявления на разном расовом ге- нетческом фоне одной и той же мутации - мажорной 16-кб деле- ции, обнаруживаемой у 27% пациентов с детской формой болезни Зандхоффа (McInnes et al.,1992; Sidransky et al.,1994). В частности, в одной франко-канадской семье эта мутация в ком- паунде с миссенс мутацией P417L, описанной впервые в Японии у пациента с подростковой формой заболевания, провлялась как взрослая форма с очень мягким течением заболевания. В ряде случаев удалось проанализировать молекулярную природу совместного влияния двух аллелей одного гена на фе- нотип. К примеру, при некоторых форм метахроматической лей- кодистрофии трудность молекулярной диагностики заболевания связана с существованем, так называемого, псевдодефицитного аллеля ARSA-гена. Этот полиморфный аллель встречается в по- пуляциях с достаточно высокой частотой, так что гомозиготы по нему состаляют 1 - 2% всего населения. Оказалось, что псевдодефицитный аллель представляет из себя сочетание двух мутаций в цис-положении. Одна из них - 3'-концевая ругуля- торная мутация в первом сайте после стоп кодона, изменяет сигнал полиаденилирования. Другая - миссенс мутация в 6-м экзоне, приводит к потере сайта N-гликозилирования. Попутно отметим, что для гена ARSA (также как и для IDUA-гена) обна- ружен альтернативный сплайсинг, в результате которого в фиб- робластах и печени образуются 2 различных типа мРНК, разме- ром 2.1 кб и 3.9 кб, соответственно. У гомозигот по псевдо- дефицитному аллелю в фибробластах отсутствует 2.1 кб мРНК, при этом клинических проявлений заболеваний не наблюдается. Однако, при наличии S96F мутации в ARSA-гене на фоне псевдо- дефицитного аллеля развивается тяжелая форма лейкодистрофии. В заключении раздела кратко рассмотрим состояние проб- лемы генокоррекции лизосомных заболеваний. В литературе отсутствуют сообщения об успешных клинических испытаниях программ генотерапевтического лечения этих заболеваний, од- нако, по крайней мере, для некоторых лизосомных болезней та- кие программы уже разработаны и утверждены (см.Главу IX, Табл.9.2). Имеются сведения о положительных результатах та- ких исследований на культурах мутантных клеток и на модель- ных животных. Так, в опытах in vitro был осуществлен успеш- ный ретровирусный перенос нормальной кДНК гена GBA в культу- рах мутантных фибробластов (Sorge et al.,1987) и в культурах клеток крови пациентов с болезнью Гоше (Fink et al., 1990), в результате чего была достигнута коррекция глюкоцеребрози- дазной активности. Такая же коррекция метаболическоих дефек- тов при болезни Ниманна-Пика и при синдроме Хантера была достигнута путем введения в соответствующие мутантные линии клеток нормальных кДНК генов SMPD1 и IDS соответственно. При этом активность идуронат-2-сульфатазы после ретровирусной трансдукции in vitro оказалась существенно выше нормальной и рекомбинантный фермент активно участвовал в метаболизме глю- козамногликанов. Генокоррекция первичного биохимического де- фекта при мукополисахаридозе YII (синдром Слая) была получе- на как in vitro, путем ретровирусного переноса нормального гена GUSB в мутантные фибробласты человека, так и in vivo на собаках и мышах. При этом у больных собак нормальный белок (бета-глюкуронидаза) не только экспрессировался, но появ- лялся в лизосомах и восстанавливал процессинг специфических глюкозоаминогликанов (Wolf et al., 1990). Введение этого же гена (GUSB) в мутантные стволовые клетки мышей приводило к длительной экспрессии бета-глюкуронидазы, снижению лизосо- мального накопления в печени и мозге и частичной коррекции болезни у трансгенных животных (Wolf et al.,1992). В другом эксперименте GUBS-кДНК вводили в культивируемые мутантные фибробласты кожи мышей и затем трансдуцированные клетки имп- лантировали подкожно мутантным мышам. У всех животных наблю- дали экспрессию введенного гена и полное исчезновение ли- зосомальных отложений в печени и в мозге (Sly, 1993). Полу- ченные результаты подтверждают принципиальную возможность лечения, по крайней мере, некоторых лизосомных болезней с помощью методов генной терапии. Раздел 10.3. Болезни экспансии, вызванные "динамически- ми" мутациями. Обнаруженный в 1991г. новый тип так называемых динами- ческих мутаций и связанные с ними наследственные заболевания частично рассматривались нами в Главе IV. Однако их уникаль- ность, необычный механизм экспрессии, особенности наследова- ния, быстрый рост нозологий, обусловленных подобными наруше- ниями в последовательности ДНК, и, как оказалось, достаточно широкая распространенность (см.Табл.9.2) делают целесообраз- ным их более подробный анализ. Как упоминалось, этот тип мутаций пока найден только у человека и не зарегистрирован ни у одного вида млекопитающих или других хорошо изученных организмов (дрозофила, нематоды и пр.). Суть мутаций заключается в нарастании числа триплет- ных повторов, расположенных в регуляторной или в кодирующей, а значит и в транслируемой части генов. Впервые такой тип мутации был обнаружен при молекулярном анализе синдрома фра- гильной (ломкой) Х-хромосомы, наследственная передача кото- рой не подчинялась обычным менделевским законам. В дальней- шем аналогочные динамические мутации были описаны и при 7 других наследственных заболеваниях, контролируемых генами, расположенными на разных хромосомах - Таблица 10.2. Вместе с тем, все нижеперечисленные нозологии имеют ряд общих призна- ков, позволяющих объеденить их в одну самостоятельную груп- пу. Прежде всего, для триплетных повторов, экспансия которых блокирует функцию гена, характерен выраженный популяционный полиморфизм, причем число аллелей может варьировать от еди- ниц до нескольких десятков. Другой их особенностью является доминантный тип наследования, характерный как для Х-сцеплен- ных генов, так и для генов, находящихся на аутосомах. Осо- бенностью практически всех болезней "экспансии" является также эффект антиципации (ожидания), смысл которого заключа- ется в нарастании тяжести симптомов заболевания в последую- щих поколениях, что, как оказалось, является результатом на- копления ("экспансии") исходного числа триплетов после того как их количество возрстает больше нормального. Характерными для этих нозологий являются и особенности их передачи по- томству: для некоторых заболеваний типична передача по мате- ринской (Fra-X, миотоническая дистрофия), а для других - преимущественно по отцовской линии (хорея Гентингтона). Практически для всех "динамических" мутаций характерно пора- жение головного мозга и особенно подкорковых структур, при- чем тяжесть заболевания и его начало четко коррелируют с числом повторов. Молекулярный анализ этих генов позволяет предполагать определенное сходство механизма экспансии трип- летов, которая, по всей вероятности, происходит в митозе, затрагивает чаще аллели с начально большим числом повторов, при этом нередко сигналом экспансии является утрата негомо- логичного триплета, в норме разделяюего цепочку монотонных повторов. Вместе с тем, патогенетические механизмы проявле- ния мутаций экспансии принципиально различны. В случае раз- личных вариантов FRAX мутаций наблюдается блок экспрессии соответствующих генов вследствие стабильного метилирования области CpG островка в промоторной части генов. При миотони- ческой дистрофии нарушение экспрессии, по-видимому связано с ошибками взаимодествия транскрибируемой нити ДНК с нуклеосо- мами. В случае остальных сугубо нейродегенеративных заболе- ваний (хорея Гентингтона, спинально-бульбарная мышечная ат- рофия и др.) экспрессия гена не нарушена, однако, образую- щийся белковый продукт с необычно длинной полиглутаминовой цепочкой каким-то образом нарушает процессы нормального ме- таболизма нервных клеток подкорковых отделов мозга. Таким образом, причиной повреждающего действия одних "динамических" мутаций является блок генной экспрессии, то есть потеря функции (loss-of-function mutation), тогда как другие мутации того же типа, связанные с нейродегенративными заболеваниями, ведут к появлению белковых продуктов с ано- мальными функциями ( мутации типа -gain-of-function). Инте- ресно отметить, что помимо динамических мутаций для каждого названного гена обнаружены единичные точковые мутации, число которых крайне невелико. Для каждой болезни "экспансии" раз- работан свой вариант диагностики, основанный на ПЦР. Ампли- фикация области триплетных повторов и дальнейший электрофо- ретический анализ синтезированных продуктов позволяет опре- делить число повторов, то есть провести генотипирование ал- лелей. Вместе с тем, при числе повторов более 200, амплифи- кация с помощью ПЦР обычно не достигается. В этих случаях размеры участка повторов определяются методом блот-гибриди- зации с соответствующими ДНК зондами. Например, используются зонды StB12.3, Ох1.9 или Ох 0.55 в случае синдрома FRAXA; зонд cDNA25 в случае миотонической дистрофии. Подробней с этой интересной группой заболеваний можно ознакомиться в ряде обзоров (Willems, 1994; Баранов и др.,1993; Иллариошкин и др., 1995). Таблица 10.2. Болезни экспансии, вызванные динамическими му- тациями. -----------------------T-----------T-------T-----T------T------T------------- ---------¬ Болезнь, номер по ¦ Ген, лока-¦Триплет¦Норма¦Прему-¦Мута- ¦Литература ¦ МакКьюсику (MIM) ¦ лизация ¦ ¦ ¦тация ¦ция ¦ ¦ -----------------------+-----------+-------+-----+------+------+------------- ---------+ Синдром ломкой X-хро- ¦FMR1, FRAXA¦(CGG)n ¦5-50 ¦50-90 ¦>90 ¦Rousseau et al.,1991 ¦ мосомы; 309550¦Xq27.3 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Hirst et al.,1991 ¦ -----------------------+-----------+-------+-----+------+------+------------- ---------+ Синдром ломкой X-хро- ¦FMR2, FRAXE¦(CGG)n ¦6-25 ¦25-200¦>200 ¦Knight et al.,1994 ¦ мосомы тип 2; 309548¦Xq27.3 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ -----------------------+-----------+-------+-----+------+------+------------- ---------+ Миотоническая дистро- ¦DM, MP-1 ¦(CTG)n ¦5-10 ¦19-30 ¦>30 ¦Shelbourne et al.,1992¦ фия; 160900¦19q13.3 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Wieringa,1994 ¦ -----------------------+-----------+-------+-----+------+------+------------- ---------+ Хорея Гентингтона; ¦HD, IT-15 ¦(CAG)n ¦6-37 ¦ ¦37-121¦Huntington's Dis. ¦ 143100¦4p16.3 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Collab.Res.Group,1993 ¦ -----------------------+-----------+-------+-----+------+------+------------- ---------+ Спинально-мозжечковая ¦SCA1 ¦(CAG)n ¦6-39 ¦ ¦41-81 ¦Orr et al.,1993 ¦ атаксия тип 1; 164400¦6p21.3 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Chung et al.,1993 ¦ -----------------------+-----------+-------+-----+------+------+------------- ---------+ Денто-рубральная-палли-¦DRPLA, B-37¦(CAG)n ¦7-34 ¦ ¦54-75 ¦ Koide et al.,1994 ¦ до-люисовая дегенерация¦12pter-p12 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ Nagafuchi et al.,1994¦ 125370¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ -----------------------+-----------+-------+-----+------+------+------------- ---------+ Спинально-бульбарная ¦AR ¦(CAG)n ¦12-33¦ ¦40-62 ¦La Spada et al.,1991 ¦ мышечная атрофия;313200¦Xq11-q12 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ -----------------------+-----------+-------+-----+------+------+------------- ---------+ Спинально-мозжечковая ¦MJD ¦(CAG)n ¦13-36¦ ¦68-79 ¦Kawaguchi et al.,1994 ¦ дегенерация Мачадо- ¦14q32.1 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ Джозефа ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ -----------------------+-----------+-------+-----+------+------+------------- ---------- Раздел 10.4. Моногенные наследственные болезни, диаг- ностируемые молекулярными методами в России. Сводка, представленная в таблице 10.3, составлена на основании анализа работ основных отечественных лабораторий и публикаций, связанных с проблемой молекулярной диагностики наследственных болезней. Сводка не является исчерпывающей и включает преимущественно те заболевания для которых возможна или уже проводится диагностика на внутриутробных стадиях развития (Баранов, 1994). Таблица 10.3. Моногенные наследственные болезни, диагности- руемые молекулярными методами и доступные пренатальной диаг- ностике в России. -----T-----------------------------------T------------------¬ ¦N пп¦ Болезни ¦Медицинские центры¦ +----+-----------------------------------+------------------+ ¦1 ¦ Муковисцидоз ¦ИАГ;ИЭМ РЦМГ; ТИМГ¦ ¦2 ¦ Миодистрофия Дюшенна/Беккера ¦ИАГ;РЦМГ; ТИМГ ¦ ¦3 ¦ Гемофилия А ¦ИАГ; ГНЦ; ¦ ¦4 ¦ Гемофилия В ¦ИАГ; ГНЦ ¦ ¦5 ¦ Фенилкетонурия ¦ИАГ; ГНЦ;ПМА;РЦМГ ¦ ¦6 ¦ Синдром ломкой Х-хромосомы ¦ИАГ; ¦ ¦7 ¦ Миотоническая дистрофия ¦ИАГ ¦ ¦8 ¦ Болезнь Виллебранда ¦ИАГ;ГНЦ ¦ ¦9 ¦ Хорея Гентингтона ¦ИАГ; РЦМГ; НИИН ¦ ¦10 ¦ Болезнь Леш-Нихана ¦ИАГ ¦ ¦11 ¦ Спинально-бульбарная мышечная ¦ИАГ; НИИН ¦ ¦ ¦ атрофия ¦ ¦ ¦12 ¦ Гепато-лентикулярная дегенерация ¦РЦМГ; ИАГ ¦ ¦13 ¦ Болезнь Хантера ¦ИАГ ¦ ¦14 ¦ Адрено-генитальный синдром ¦ЦОЗМиР; РЦМГ ¦ ¦15 ¦ Атаксия Фридрейха ¦ГНЦ ¦ ¦16 ¦ в- Талассемия ¦ГНЦ; ПМА ¦ ¦17 ¦ Болезнь Верднига-Гоффмана ¦РЦМГ ¦ ¦18 ¦ Дефицит альфа-1-антитрипсина ¦ИЭМ ¦ ¦19 ¦ Семейная гиперхолестеринемия ¦ИЭМ; ПМА ¦ ¦20 ¦ Предрасположенность к инсулин- ¦ПМА ¦ ¦ ¦ зависимому диабету ¦ ¦ ¦21 ¦ Дефицит ацил-СоА дегидрогеназы ¦ПМА ¦ L----+-----------------------------------+------------------- ИАГ - Институт Акушерства и Гинекологии РАМН, Санкт Петербург ИЭМ - Институт Экспериментальной Медицины РАМН, Санкт Петербург ПМА - Педиатрическая Медицинская Академия, Санкт Петербург РЦМГ- Российский Центр Медцинской Генетики РАМН, Москва ГНЦ - Гематалогический Научный Центр МЗ РФ, Москва ТИМГ- Томский Институт Медицинской Генетики, Томск НИИН- Научно-исследовательский Институт Неврологии РАМН, Москва ЦОЗМиР- Центр Охраны Здоровья Матери и Ребенка, Москва Молекулярные характеристики некоторых из приведенных в таблице заболеваний уже были рассмотрены в разделах 10.1 и 10.2. Отдельные аспекты, касающиеся идентификации соот- ветстующих генов, их картирования, клонирования и сканирова- ния мутаций уже упоминались в качестве примеров при изложе- нии соответствующих вводных глав монографии (см.Главы II, III, IV, V). В этой части нам представляется целесообразным суммировать эти разрозненные сведения и охарактеризовать те наиболее частые, социально значимые моногенные заболевания, в отношении которых у нас накоплен достаточно большой собственный опыт молекулярных исследований. Список этих но- зологий, их частоты и основные молекулярные характеристики приведены в Таблице 10.4. Таблица 10.4. Основные молекулярно-генетические характе- ристики моногенных болезней, диагностируемых в Лаборатории пренатальной диагностики ИАГ РАМН, Санкт-Петербург. (примечания в конце таблицы те же, что в Табл.10.1). ---------------------T--------------T-----------------------T---------------- --------¬ Синдромы 1), номер по¦Встречаемость,¦Типы и количество му- ¦Литература ¦ МакКьюсику; хромосом-¦белок, ¦таций 4), мажорные мута¦(локализация и структура¦ ная локализация; ген ¦размеры в ами-¦ции -в скобках указаны ¦генов,клонирование кДНК,¦ 2),размеры 3), экзоны¦нокислотах ¦частоты аллелей у б-ных¦идентификация мутаций). ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+---------------- --------+ Муковисцидоз; врожден¦1:2500- Европа¦Точковые-преобладающие;¦Rommens et al., 1989 ¦ ное отсутствие vas de¦1:3800 -Россия¦небольшие дел.и дупл.; ¦Kerem et al., 1989 ¦ ferens, ¦CF-трансмемб- ¦Мажорные:delF508-30-90%¦Riordan et al., 1989 ¦ 219700; 7q31.2 ¦ранный регуля-¦W1272X-2-33%,3732delA -¦Горбунова и др., 1991 ¦ CFTR.500; 260кб,27экз¦тор 1480¦4%,394delTT,G542X,R117H¦Баранов и др., 1995 ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+---------------- --------+ Миопатия Дюшенна; Бек¦1:3500 мальчи-¦Делеции протяженные - ¦Kunkel et al.,1985 ¦ кера;кардиомиопатия ¦ков ¦60%; дупликации - 6-7%;¦Kunkel et al.,1986 ¦ делеционная, ¦ ¦делеции нескольких н. -¦Koenig et al.,1988 ¦ 310200; Xp21.2 ¦Дистрофин ¦7; нонсенс - 9; сплайс.¦Roberts et al.,1992a;b ¦ DMD.21; 2000кб,73экз ¦ 3685¦-3; миссенс -1; инс.-1 ¦Ahn et al.,1993 ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+---------------- --------+ Гемофилия А, ¦1:6500 мальч. ¦Делеции экз. - 31; мис-¦Wood et al, 1984 ¦ фактора YIII деф.; ¦Фактор YIII ¦сенс - 21; нонсенс -8 ¦Toole et al., 1984 ¦ 306700; Xq28 ¦свертываемости¦Мажорные: инверсия 26 -¦Higuchi et al.,1991 ¦ F8C.66; 186 кб, 26экз¦крови 2351¦25 экзонов - 45% семей ¦Naylor et al., 1993 ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+---------------- --------+ Гемофилия B, Кристма-¦1:20000 мальч.¦Миссенс и нонсенс более¦Kurachi et al., 1982 ¦ са, фактора IX деф.; ¦Фактор IX ¦60%; сплайс.-10%; регу-¦Jagadeeswaran et al,1984¦ 306900, Xq27.1-q27.2 ¦свертываемости¦лят.- 3.5%; делеции -до¦Green et al., 1991 ¦ F9.400; 34 кб, 8 экз ¦крови 461¦40% при тяжелых формах ¦Giannelli et al., 1993 ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+---------------- --------+ фон Виллебранда бо- ¦1: 5 - 20 000 ¦Тип I и II-миссенс; Ма-¦Lynch et al., 1985 ¦ лезнь, ¦Фактор Y111R ¦жорные:R543W,R545C,V553¦Bonthorn et al., 1986 ¦ 193400; 12pter-p12 ¦свертываемости¦M,R578Q.Тип III-делеции¦Cooney et al., 1991 ¦ F8VWF.22; 178кб,52экз¦крови ¦1 н.в 28экз; нонсенс -4¦Randi et al., 1991 ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+---------------- --------+ Фенилкетонурия; гипер¦1 : 10 -15 000¦Миссенс -62%; нонсенс -¦Guttler, Woo, 1986 ¦ фенилаланинемия, мяг-¦Фенилаланин- ¦13%;сплайс.-13%;делеций¦DiLella et al., 1986 ¦ кая, 261600; 12q24.1¦гидроксилаза ¦9%; Мажорные: IVS12+1, ¦Cotton, 1990 ¦ PAH.70; 90 кб, 13 экз¦ 452¦R408W,R261Q,R158Q,IVS10¦Барановская и др. 1995 ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+---------------- --------+ Леш-Нихана синдром; ¦ ¦Миссенс -53%;небольшие ¦Jolly et al., 1983 ¦ HPRT-родств. подагра,¦Гипоксантин- ¦структ.перестройки -40%¦Edwards et al., 1990 ¦ 308000; Xq26-q27.2 ¦фосфорибозил ¦сплайс. -5%; нонсенс-2%¦Rossiter et al., 1991 ¦ HPRT.100; 44 кб,9 экз¦трансфераза217¦Мажорные: R170TER (15%)¦Sculley et al., 1992 ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+---------------- --------+ Гепато-лентикулярная ¦ ¦Миссенс -15; делеции/ ¦Bull et al., 1993 ¦ дегенерация Вильсона-¦ ¦инсерция -14;Мажорные -¦Petruchin et al., 1993 ¦ Коновалова, ¦Медь-транспор-¦H714Q - 31% в Америке, ¦Tanzi et al., 1993 ¦ 277900; 13q14.3-q21.1¦тирующая АТФа ¦22% в России; 1 н. дел.¦Thomas et al., 1995 ¦ ATP7B.34; ¦за P типа 1434¦H1070Gl-28%;Gl1267L 10%¦ ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+---------------- --------- Многим из приведенных в Табл.9.4 заболеваний посвящены обстоятельные обзоры, руководства и монографии, включающие наряду с клиническими данными специальные разделы, посвящен- ные молекулярной природе патологического процесса, характе- ристике гена, его мутаций, их фенотипических проявлений, а так же последним достижениям и перспективам лечения, включая генную терапию. Некоторые из этих публикаций уже были упомя- нуты в предыдущих разделах книги, другие будут процитированы в соответствующих подразделах этой главы. Следует так же упомянуть, что все приведенные нозологии были первыми моно- генными болезнями, которые были исследованы молекулярными методами в нашей стране и для которых, в итоге , были разра- ботаны и оптимизированы с учетом этнических и национальных особенностей аллельного полиморфизма, частот и паттерна му- таций оптимальные схемы молекулярной обследования семей высокого риска с целью пренатальной диагностики и выявления гетерозиготного носительства. Практически все эти исследова- ния проводились в рамках основных научных программ ГКНТ "Ге- ном Человека" и "Приоритетные направления генетики". Обзор отечественных работ по молекулярной диагностике наследствен- ных болезней представлен в ряде научных сводок (Баранов, 1992; 1994; Baranov, 1993; Баранов и др., 1994; Евграфов, 1993). 10.4.1 Муковисцидоз. Муковисцидоз (кистозный фиброз поджелудочной железы) - самое распространенное моногенное наследственное заболевание у представителей белой расы. Это первая "генная" болезнь, молекулярные основы которой определены методами позиционного клонирования без использования каких-либо данных о структур- ных перестройках в области локализации предполагаемого гена. Напомним, что обнаружение пациентов с транслокациями или крупными делециями, затрагивающими исследуемый ген, значи- тельно облегчает его картирование и идентификацию, как это было при миопатии Дюшенна, ретинобластоме или хроническом грануломатозе. В области локализации гена муковисцидоза хро- мосомные перестройки, практически, отсутствуют. Подробно об истории открытия гена, его структуре, клонировании, анализе функций, идентификации мутаций можно ознакомиться в следую- щих отечественных работах (Гембицкая, Баранов, 1991; Бара- нов, Гинтер, 1994). Белковый продукт гена -трансмембранный регуляторный бе- лок муковисцидоза -ТРБМ (cystic fibrosis transmembrane regulator -CFTR), как оказалось, является белком хлорных ка- налов, регулирующих обмен ионов хлора через апикальные мемб- раны всех эпителиальных клеток организма. В зависимости от типа мутаций, их локализации функция гена ТРБМ при муко- висцидозе может быть полностью или частично нарушенной. К началу 1995г. в гене ТРБМ идентифицировано более 500 мутаций, несколько делеций и дупликаций. Наболее распростра- ненной у жителей Западной Европы и Северной Америки является мутация delF508, приводящая к отстутсвию фенилаланина в 508 положении белка ЕРМБ. В этих странах частота delF508 нахо- дится в пределах 70-85%. В Европе частота мутации обнаружи- вает определенный градиент распространения с севера на юг и с запада на восток, достигая 85% в Дании она уменьшается до 50% в Италии и до 20-30% в Турции. В Европейской части России она составляет около 50% всех мутантных (CF) хро- мосом. У евреев-ашкенази доминируюшей по частоте является мутация W1282X (33%). Биохимический анализ клеток пациентов, больных муко- висцидозом, позволил выяснить фенотипические особенности экспрессии мутантных аллелей гена ТРБМ, установить опреде- ленный градиент патологических нарушений на мембранном, кле- точном и организменном уровнях в зависимости от типа мута- ции, её локализации и структуры аномального белкового про- дукта (Баранов, Гинтер,1994). Так, было установлено, что не- которые CFTR- мутации, в том числе и delF508, не препятствуя трансляции, нарушают процессинг белка так, что он не дости- гает апикальной мембраны и не создает хлорный поток. Этим объясняется тяжелая клиника муковисцидоза при подобных нару- шениях (Sheppard et al.,1993). Другие мутации ( R117H, R334W и R347P), выявленные при более мягких формах заболевания, не затрагивают процессинга белка, хлорный канал формируется, но функционирует менее эффективно, чем в норме. Сопоставление процессинга, локализации и функционирования белка в 3-х ли- ниях L-клеток, трансдуцированных нормальным CFTR-геном и двумя его аллельными вариантами, показало, что дефект одной из мажорных мутаций - G551D, связан с частичной инактивацией функции хлорного канала, в то время как delF508, как оказа- лось, обладает комбинированным эффектом - нарушает локализа- цию и стабильность белка и снижает эффективность его функци- онирования в качестве хлорого канала (Yang et al., 1993). Интересно, что мутация R117H в гомозиготном состоянии, чаще в компаунде с другими аллелями, в том числе с delF508, обна- руживается у пациентов с врожденным отсутствием семявыводя- щих канальцев (vas deferens). При этом клиника муковисцидоза у таких пациентов, как правило, отсутствует или очень стер- та. Это еще один из примеров фенотипического разнообразия, обусловленного аллельными сериями. В настоящее время в России доступны идентификации по наличию известных мутаций около 65% больных муковисцидозом (Иващенко,1992; Потапова,1994). Диагностическая ценность основных мажорных мутаций в порядке убывания их частоты сле- дующая delF508 (50%), 3732delA (4,3%), W1282X (2,4%), 394delTT (2,1%); G542X (2,0%) (Иващенко, 1992). Cогласно на- шим данным (Баранов, 1994) молекулярная диагностика муко- висцидоза прямыми методами возможна примерно в 55 -60% се- мей. В случае непрямой диагностики используются полиморфные сайты локусов ДНК, расположенные в непосредственной близости (IRP, D7S8, D7S23, MET) или внутри самого гена CFTR - ми- нисателлитные последовательности в интронах 6, 8, 17b гена СFTR (Zielenski et al., 1991; Morral et al., 1991; Chehab et al., 1991; Агбангла и др., 1992; Potapova et al., 1994). При отсутствии мажорных мутаций и информативности по полиморфным сайтам молекулярные исследования могут быть дополнены биохи- мическим анализом амниотической жидкости на содержание фер- ментов микроворсинок кишечника плода (Гобунова и др.,1989; Баранов и др.,1991). Методами направленного мутагенеза (gene targeting см. Главу VIII) в различных лаборатория США и Великобритании осуществлено успешное конструирование трансгенных моделей муковисцидоза на мышах (Clarke, et al., 1992; Colledge et al., 1992; Dorin et al., 1992; Snouwaert et al., 1992). Вы- яснены признаки сходства и некоторые межвидовые различия проявления мутации гена CFTR у мышей и человека. Показано, что различные мутации этого гена по-разному реализуются в фенотипе СFTR дефицитных мышей. Так, в одной из трансгенных линий отмечено преимущественное поржаение легких, у других - поджелудочной железы и кишечника. В одной мутантной линии наблюдается гибель большого числа зародышей от причин, сход- ных с мекониальным илеусом. Таким образом, эти линии представляют собой идеальные модели для исследования молеку- лярных основ патогенеза муковисцидоза, а также для разработ- ки и испытания терапевтических мероприятий, включая геноте- рапию. Как уже отмечалось в предыдущей главе, программы ге- нотерапии муковисцидоза реализуются по крайней мере в 7 центрах США и двух центрах Западной Европы (Великобритания и Франция). Уже успешно осуществлены не только апробации ген- ноинженерных конструкций на мутантных культурах клеток и мо- дельных животных, но начаты и успешно проводятся клинические испытания генотерапевтического лечения муковисцидоза на 70 пациентах. Исследования по генотерапии муковисцидоза, нача- тые в нашей стране пока проводятся на уровне клеточных куль- тур. 10.4.2 Миодистрофия Дюшенна. Миодистрофия Дюшенна - сцепленная с полом мышечная дистрофия; выделяют две клинические формы: тяжелую - мио- дистрофию Дюшенна (МД) и гораздо более мягкую - миодистрофию Беккера (МБ). Ген миодистрофии Дюшенна (DMD) - один из самых крупных известных генов человека, кодирует белок дистрофин, входящий в состав сарколеммы мышечного волокна. При МД дист- рофин либо полностью отсутствует, либо деградирует вскоре после синтеза. При форме Беккера, как правило, дистрофин присутствует, хотя и в измененном, чаще всего в укороченном состоянии. В соответствии с современными представлениями (Ahn, Kunkel, 1993) огромный DMD-ген находится под контролем слож- ной системы регуляции транскрипции и сплайсинга. По крайней мере, 5 независимых промоторов осуществляют альтернативную специфическую транскрипцию первых экзонов в разных тканях и на разных стадиях эмбрионального развития. 3 промотора экспрессируют полноразмерную молекулу дистрофина, в то время как 2 осущесвляют экспрессию последних доменов взаимоисклю- чающим способом. Высоко консервативные последовательности 6- и экзонов, кодирующих C-конец белка, альтернативно сплайси- руются, образуя несколько структурно различающихся форм дистрофина, осуществляющих различные функции. Так, идентифи- цирована 6.5-кб мРНК, транскрибируемая с DMD-гена и являюще- еся, по-видимому, его основным продуктом в не-мышечных тка- нях, включая мозг (Bar et al.,.1990). Соответствующий белок значительно отличается от дистрофина и его уровень в некото- рых не-мышечных тканях сопоставим с количеством дистрофина в мышцах. Описан также 4.8-кб транскрипт того же локуса, экспрессирующийся во многих типах тканей, но особенно в Шванновских клетках проводящей нервной системы, где сам дистрофин отсутствует (Blake et al., 1992). Этот белок полу- чил название апо-дистрофин-1. Клонирован и секвенирован еще один 2.2-кб транскрипт DMD-гена, кодирующий аподистро- фин-3, экспрессирующийся в позднем эмбриогенезе (Tinsley et al., 1993). В 60% случаев в гене DMD у больных мальчиков обнаружи- ваются протяженные делеции, захватывающие от одного до нескольких соседних экзонов и сосредоточеные, обычно, в двух "горячих" районах - в области 5'-конца гена (экзоны 6-19) и в 3'- конце (экзоны 40-53), при этом 30% делеций локализова- ны в проксимальной части гена и 70% - в дистальной. Прокси- мальные делеции возникают, по-видимому, в раннем эмбриогене- зе и имеют больше шансов стать "семейными" мутациями. Дистальные делеции возникают позднее и чаще встречаются, как изолированные случаи. Считается, что в спорадических случаях повторный риск рождения больного ребенка при проксимальной делеции составляет 30%, тогда как при дистальной - только 4% (Passos-Bueno et al., 1992). Отмечены популяционные особенности паттерна делеций в разных европейских популяциях, а также в популяциях России и стран СНГ (Baranov et al., 1993). У некоторых пациентов де- летирован не только весь ген, но достаточно протяженные соседние области. Очень часто концы делеций локализованы в центральной части дистрофинового гена. Так в интроне 44, протяженностью 160-180 кб, расположено около 30% точек раз- рыва всех делеций. Показано, что проксимальный конец одной из делеций в интроне 43 расположен внутри транспозон-подоб- ного элемента, принадлежащего THE-1 семейству ретротранспо- зонов (Pizzuti et al.,1992). Описан еще один пациент, у ко- торого делеция оканчивается в THE-1 элементе. Эти элементы, размером 2.3 кб, фланкированные 350-нуклеотидными LTR, пов- торены около 10 000 раз в геноме человека. Гипотеза неста- бильности DMD-гена, вызванная присутствием транспозон-подоб- ного элемента, привлекается также для обьяснения нескольких случаев обнаружения различий в молекулярном дефекте у паци- ентов, принадлежащих одной и той же родословной, то есть имеющих мутацию общего происхождения (Miciak et al.,1992). В 2-х случаях дупликаций из 8, для которых был проведен сик- венс концевых участков, показано присутствие Alu-элементов. В остальных 6 случаях рекомбинация осуществлялась между не- гомологичными последовательностями (Hu, Worton, 1992). Прямой корреляции между тяжестью течения заболевания и протяженностью делеции не отмечается, но различия между фор- мами Дюшенна и Беккера, в общем случае, связаны с наличием или отсутствием сдвига рамки считывания. Ген дистрофина мо- жет быть вовлечен также в другие структурные перестройки - дупликации, транслокации. Так, примерно 5% мутаций гена дистрофина составляют дупликации и около 35%-точечные мута- ции, преимущественно, микроделеции (от 1 до нескольких нук- леотидов), а также нонсенс мутации. Относительно высокий процент нонсенс мутаций в гене дистрофина связывают с присутствием большого количества глютаминовых триплетов, му- тации в котором часто приводят к образованию стоп-кодона. Крайне редки миссенс мутации. Считается, что в 30% семей с МД и МБ мутации спонтанного происхождения и возникают преи- мущественно в оогенезе, в остальных семьях это наследствен- ные формы. Разработаны очень эффективные методы диагностики деле- ций в DMD-гене, основанные на мультиплексной ПЦР. Одновре- менное тестирование 18 экзонов + промоторной части гена поз- воляет выявить до 98% всех крупных делеций гена (Baranov et al., 1993). Для обнаружения гетерозиготного носительства де- леций используется метод RT PCR, то есть изоляция эктопи- ческой DMD-мРНК из клеток крови, обратная транскрипция, амп- лификация кДНК, рестрикционный анализ и секвенирование (Roberts et al.,1991). Для этой же цели применяется метод иммунодетекции мутантного белка в белковом лизате мышц и на гистологических срезах биоптатов мышц (Arahata et al.,1989). При отсутствии идентифицируемой делеции применяют косвенный метод ДНК-диагностики с использованием внутриген- ных полиморфных сайтов: pERT87-8/Taq1; pERT87-15/BamH1; 124/Pst1;16intron/ Taq1, и аллельных вариантов динуклеотид- ных СА повторов в интронах 49 и 50 - STR-49; STR-50 (Малыше- ва и др., 1991; 1992; Евграфов, Макаров, 1987; Евграфов и др., 1990). Серьезную проблему для диагностики гетерозиготного носительства и, следовательно, для медико-генетического консультирования предствляют случаи, так называемого, гонад- ного мозаицизма - присутствие в соматических клетках гонад женщины-неносительницы мутаций гена дистрофина, что, в свою очередь, приводит к появлению нескольких генераций (клонов) половых клеток (ооцитов) с мутанынм и нормальным генами дистрофина. Предполагается, что такие мутации могут возни- кать еще на уровне первичных половых клеток, то есть на ран- них стадиях внутриутробного развития будущей матери. По ори- ентировочным оценкам примерно 6-7% всех спорадических случа- ев являются следствием гонадного мозаицизма у матери. Оце- нить величину аберрантного клона ооцитов практически не представляется возможным. В связи с этим прогноз в отношении здоровья следующего ребенка в семьях, в которых у матери больного МД не удается определить гетерозиготное носительст- во, весьма затруднен. Эмпирически определено, что при нали- чии спорадического случая рождения ребенка с МД и при отсутствии прямых молекулярных доказательств гетерозиготного носительства мутации гена дистрофина у матери риск повторно- |
|
© 2010 |
|