: Литература - Другое (книга по генетике)

: Литература - Другое (книга по генетике)

трансферрин, эритропоэтин, асиалоглюкопротеин, коньюгирован-

ный с альбумином инсулин и некоторые другие, взаимодействую-

щие с клеточными рецепторами и обеспечивающие фиксацию ген-

ной конструкции на специфических клетках, то есть адресную

доставку чужеродной ДНК в клетки определенного типа (напри-

мер асиалоглюкопротеин - в клетки печени, трансферрин и

эритропоэтин - в клетки крови и.т.д). Лиганды ковалентно

присоединяются к связывающим и компактизующим чужеродную ДНК

катионным носителям (полилизину, DEAE-Dextran и др.).

Важным компонентом системы является аденовирус или его

N-концевой фрагмент, выступающие в качестве эффективных фу-

зогенных агентов, обеспечивающих выход экзогенной ДНК из эн-

досом после попадания ее в цитоплазму клеток-мишеней. Адрес-

ная доставка и эффективная защита от лизосомальных ферментов

обеспечивают высокую трансфекционную способность таких конс-

трукций, их несомненную перспективность для генной терапии

in vivo (Hodgson, 1995).

Мы уже упоминали о возможности сочетания векторного и

физико-химического подхода при конструировании систем для

переноса генов в клетки человека. Одна из таких систем осно-

вана на использовании филаментного фага fd для трансфекции

эпителиальных клеток. Гены fd, кодирующие белки оболочки фа-

га, экспрессируются на его поверхности. В один из них инсер-

тируют последовательность, кодирующую поли-L-лизин. Полили-

зиновые остатки в составе слитого белка связываются с плаз-

мидной ДНК и удерживают ее на поверхности фага. В другой ген

оболочки фага инсертируют последовательость ДНК, кодирующую

какой-либо агент, специфически связывающийся с апикальной

поверхностью эпителиальных клеток и интернализирующий (обес-

печивающий проникновение) фага внутрь клетки. С этой целью

были апробированы гены белков патогенных бактерий, поражаю-

щих кишечный эпителий - интерналин и инвазин, а также после-

довательности ДНК, кодирующие пептидные фрагменты вариабель-

ного района моноклональных антител Ab11. Было показано, что

во всех трех случаях достигается адресная доставка и интер-

нализация фага в клетки-мишени, то есть система успешно

функционирует.

Направленный перенос генов во многие типы клеток, со-

держащие трансферриновые рецепторы, может быть осуществлен

при комплексировании ДНК с трансферрином. Использование в

этом комплексе аденовирусного вектора существено облегчает

прохождение ДНК через эндосомы и попадание её в ядро. Иде-

альными белковыми лигандами для специфических клеточных ре-

цепторов могут служить моноклональные антитела или их фраг-

менты, направленные против тех элементов рецепторов, которые

находятся на наружной поверхности клеточной мембраны. Подоб-

ная система разработана для рецептор-опосредованного генного

переноса в эпителиальные клетки. Она основана на использова-

нии противо-секреторных SCFab-фрагментов антител для поли-

мерного иммуноглобулинового рецептора pIgR. Этот рецептор

транспортирует IgA и IgM в респираторные эпителиальные клет-

ки, связывая иммуноглобулины и интернализируя их путем эндо-

цитоза. Показано, что в системе in vitro частота трансфекции

эпителиальных клеток при использовании SCFab-поли-L-ли-

зин-ДНК комплекса такая же, как и при введении экзогенной

ДНК посредством трансферринового рецептора. Аналогичные под-

ходы могут быть применены для введения генов и в другие типы

клеток.

9.4.3 Липосомный метод трансфекции.

Эффективный внутриклеточный транспорт и защита от дег-

радации лизосомальными ферментами достигаются при использо-

вании в качестве векторов липосом-липидных пузырьков, обла-

дающих выраженными фузогенными свойствами - способностью

сливаться с клеточными мембранами. Особенно перспективны в

этом отношении липосомы, полученные на основе катионных ли-

пидов, обеспечивающих 100% связывание ДНК в конденсированные

нуклеолипидные частицы. Положительный заряд на поверхности

таких пузырьков обеспечивает их активное слияние с отрица-

тельно заряженными клеточной мембранами и прямое попадание

чужеродной ДНК в цитоплазму, минуя эндосомы и, соответствен-

но, не подвергаясь действию лизосомных гидролаз. Очень эф-

фективный перенос высокоочищенных ДНК или РНК-последователь-

ностей в соматические, особенно, в мышечные ткани может быть

осуществлен с помощью препаратов липофектина или липофекта-

мина (Caplen et al., 1994). Гораздо более высокая частота

трансфекции по сравнению с липосом-опосредованным переносом

получена в экспериментах на культурах клеток при использова-

нии ДНК-липидного комплекса с циклическим амфипатическим

пептидом грамицидином S.

Особенно перспективными в последнее время представляют-

ся комплексы, в которых липосомы коньюгируют с мембранными

антителами к определенным белкам-мишеням (иммунолипосомы)

либо с белками-лигандами (см.выше). Эти конструкции обеспе-

чивают эффективную адресную доставку чужеродной ДНК в клет-

ки-мишени. Подобная схема была успешно апробирована для пе-

реноса гена сывороточного альбумина человека в гепатоциты

линейных крыс Nagase с наследственной дисальбуминемией. До-

казано присутствие и экспрессия введенного таким образом ге-

на человека в клетках печени крыс. Аналогичные результаты

получены в опытах на линейных кроликах Watanabe, дефектных

по рецепторам липопротеинов низкой плотности - LDL. Эти жи-

вотные моделируют одно из наиболее частых моногенных заболе-

ваний человека - семейную гиперхолесеринемию. При внутривен-

ной иньекции кроликам липидного асиалогликопротеинового

комплекса с плазмидной ДНК, несущей нормальный LDL-ген, уро-

вень холестерина в крови животных устойчиво понижался.

Важным преимуществом рецептор-опосредованных систем на

основе липосом является их низкая иммунореактивность. Они

лишены и многих других недостатков, свойственных вирусным

векторным системам. Вместе с тем, до сих пор не решена проб-

лема низкой частоты трансформации клеток при липосомном пе-

реносе. Это обстоятельство существенно ограничивает примене-

ние липосом в генной терапии (Crystal, 1995). Тем ни менее,

в настоящее время рецептор-опосредованный вариант передачи

генетической информации в клетки эукариот с использованием в

качестве лигандов специфических антител, рецепторных белков,

а также вирусных последовательностей и липосом позволяет в

одной системе совместить преимущества физико-химических ме-

тодов переноса ДНК и вирусных векторов и потому представляет

один из наиболее перспективных и быстро развивающихся нап-

равлений в трансфекции эукариотических клеток.

9.4.4 Рекомбинантные вирусы.

Конструирование векторов на базе вирусов представляет

собой наиболее интересный и перспективный раздел генотера-

пии. Эволюционно сложившаяся система обеспечения эффективно-

го проникновения в клетки-мишени, а в случае ретровирусов и

система интеграции в клеточный геном, позволяет рассматри-

вать вирусы как естественные векторы чужеродной ДНК для кле-

ток млекопитающих. Действительно, только с помощью вирусных

векторов пока удается достичь такого уровня трансфекции кле-

ток человека in vitro и in vivo, который необходим для про-

явления лечебного эффекта. Это доказывают многочисленные

эксперименты на животных и первые клинические испытания ут-

вержденных программ генотерапии (см. 9.2). Вместе с тем,

нельзя недооценивать и вполне реальную опасность патологи-

ческих процессов, связанных с использованием вирусных час-

тиц. В качестве векторов применяют следующие рекомбинантные

вирусы: ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные виру-

сы, вирус герпеса, вирус спида (HIV), вирус ветряной оспы и

некоторые другие (Anderson, 1992; Culver, 1994; Lowenstein,

1994; Hodgson, 1995; Kay, Woo, 1992). Учитывая большую прак-

тическую значимость этих векторов, рассмотрим их более под-

робно.

_Ретровирусные векторы. . Генные конструкции на основе

ретровирусов (РНК-содержащих вирусов) особенно часто исполь-

зуются для трансдукции ДНК ex vivo. Наиболее популярный рет-

ровирусный вектор - вирус мышиного лейкоза Molony (MoMLV).

По сравнению с другими типами векторов ретровирусы обладают

уникальной способностью эффективно переносить чужеродные ге-

ны и стабильно интегрировать их в геном делящихся соматичес-

ких клеток. Для безопасности ретровирусные последовательнос-

ти модифицируют таким образом, что в инфецированных ими

клетках вирусные белки не производятся. Это достигается за

счет удаления или инактивации всех кодирующих последователь-

ностей вируса. Репликация вирусных векторов может происхо-

дить только в специальных "пакующих" клетках, в геном кото-

рых встроены все гены, производящие вирусные белки. При вве-

дении ретровирусных векторов в эти клетки образуются вирио-

ны, несущие векторную РНК и способные лишь проникать в клет-

ки-мишени, но не размножаться в них. Недостатком этой систе-

мы, также как и других векторных систем на основе вирусов,

является возможность контаминации производящей клеточной ли-

нии нормальным ретровирусом и получения на этой основе ком-

петентного по репликации вектора. Для предотвращения этого

необходимо регулярное тестирование "пакующей" линии клеток.

Возможна также контаминация ретровирусного вектора клеточны-

ми РНК, некоторые из них могут обратно транскрибироваться и

встраиваться в геном трансдуцированных клеток. Последстия

такого события могут быть выявлены в экспериментах на живот-

ных моделях. Другими серьезными недостатками ретровирусных

векторов является: (1) их способность переносить генетичес-

кий материал только в пролифирирующие клетки; (2) способ-

ность индуцировать мутации при случайной интеграции в геном;

(3) возможность спонтанной активации онкогена; (4) небольшие

размеры переносимой ДНК-вставки - до 8 тысяч п.о.; (5) срав-

нительно низкий титр -10!6-10!7/мл рекомбинантных вирусных

частиц, получаемых для трансдукции; (6) необходимость конс-

труирования соответствующих "пакующих" клонов клеток.

_Аденовирусные векторы. . В отличие от ретровирусов адено-

вирусы активно инфецируют неделящиеся клетки, обладают боль-

шей потенциальной пакующей способностью (ДНК-вставка> 8 кб),

имеют высокий титр - 10!11/ мл, однако, не обеспечивают

встраивание чужеродной ДНК в геном трансформированной клетки

(Hodgson, 1955). Использование их перспективно для генокор-

рекции клеток верхних дыхательных путей, легких и других ор-

ганов - мозга, печени, мышц, кожи и пр. Они эффективны при

доставке аэрозольным способом, что было использовано в пер-

вых клинических испытаниях по генотерапии муковисцидоза

(Crystal et al., 1994). В аденовирусные векторы также инсер-

тируют маркерные гены - neo, CAT или бета-галактозидазный

ген (бета-Gal) для того, чтобы идентифицировать трансдуциро-

ванные клетки. Для конструирования векторов используют де-

фектные по репликации аденовирусы, которые получают путем

вырезания из вирусной ДНК генов, кодируюших белки (E1a,

E1b)- так называемые аденовирусные векторы 2-го поколения. В

настоящее время создаются аденовирусные векторы 3-го поколе-

ния, в которых помимо генов Е1а и Е1b удаляют и регуляторный

ген Е4. Такая конструкция может поддерживаться только в при-

сутствии клеток-хелперов (например, в культуре клеток почек

человека). Удаление большего числа аденовирусных генов из

векторов часто сопровождается их дестабилизацией. Это один

из главных недостатков аденовирусных векторов, так как в ря-

де случаев остающиеся гены, трансдуцированные в клетки-мише-

ни, способствуют формированию иммунного ответа. Именно выра-

женный иммунный ответ при повторных введениях аденовирусного

вектора с инсерцией гена CFTR, оказался наиболее серьезным

препятствием для успешной генотерапии муковисцидоза (Crystal

et al., 1994). Некоторые аденовирусные белки способны оказы-

вать цитотоксический эффект на высокоспециализированные

клетки человека. Схема поддержания аденовирусных векторов

сходна с той, которая используется для производства ретрови-

русных векторов. Велика опасность их контаминации хелперным

реплицирующимся вирусом. Кроме того, аденовирусы редко ин-

тегрируются в геномную ДНК и потому экспрессия переносимых

ими генов, как правило, носит временный характер

(Табл. 9.1). Способность инфецировать, практически, любые

клетки как in vivo, так и in vitro делает особенно актуаль-

ной адресную доставку таких конструкций и введение в их сос-

тав тканеспецифических промотров. Например, промотор гена

альфа-фетопротеина при необходимости экспрессии гена в клет-

ках печени, либо промоторы генов сурфактантных белков В и С

для экспрессии чужеродных генов в клетках легких.

_Аденоассоциированные вирусы . обладают значительно мень-

шей пакующей способностью (около 5 кб). Однако, в отличие от

ранее рассмотренных вирусов не обладают онкогенной актив-

ностью, не патогенны, способны интегрироваться в геном, где

пребывают в латентном состоянии. Уникальной особенностью AAV

является их способность к стабильной неслучайной интеграции

в один из районов хромосомы 19. Специфичность интеграции ви-

руса определяется наличием в его геноме гена rep. Близко

родственные AAV, так называемые, парвовирусы (H1, MVM, Lu-

III), обладают еще меньшей пакующей способностью - около 2

кб и не имеют специфичного встраивания, однако, они также

рассматриваются как потенциально перспективные векторы.

_Вирус простого герпеса (HSV). . Крупный (152 кб) ДНК-со-

держащий вирус, при трансформации не интегируется в геном,

формируя в ядрах эписомные структуры. Уникальная особенность

HSV является его выраженная тропность к клеткам нервной сис-

темы. Отсюда его перспективность как векторной системы для

лечения опухолей мозга, болезни Паркинсона и многих других.

Его известное преимущество - достаточно большая пакующая

способность (>30кб). Важным этапом в создании вектора на ос-

нове HSV является удаление из его генома области ICP22, от-

ветственной за синтез литических белков, и индукция мутации

1814, вызывающей блок транскрипции вирусной ДНК. В последнее

время на основе HSV стали получать искусственные производные

вируса, так назывемые ампликон-продукты, лишенные, практи-

чески, всех генов HSV, но способные к репликации .

Конструкции векторов, используемых для переноса экзо-

генных ДНК в клетки человека, постоянно совершенствуются в

зависимости от типа клеток-мишеней. Так, новый тип векторов,

сконструированных на основе псевдо-аденовирусов, сочетает в

себе все преимущества аденовирусных векторов, но при этом

собственные вирусные гены, практически, не оказывают никако-

го повреждающего эффекта на трансфецированные клетки-мише-

ни, так как содержат очень мало регуляторных элементов и

последовательностей, ответственных за упаковку и репликацию

аденовируса. Кроме того, псевдо-аденовирусные векторы с ус-

пехом переносят чужеродные последовательности ДНК как в де-

лящиеся, так и в покоящиеся клетки. Изучаются также перспек-

тивы использования для генной терапии других вирусных сис-

тем, таких как SV40, вирус иммунодефицита (HIV), вирус вет-

ряной оспы и многие другие. В частности, заслуживают внима-

ния эписомные (неинтегрирующиеся в геном реципиента) векто-

ры, полученные на основе очень крупного вируса Эпштейн-Бар-

ра, способного нести вставку размером от 60 до 330 кб (Sun

et al., 1994).

9.4.5 Перспективы создания "идеальных" векторных систем.

Обзор существующих данных позволяет придти к заключе-

нию, что, несмотря на усилия многих лабораторий мира, все

уже известные и испытанные in vivo и in vitro векторные сис-

темы далеки от совершенства (Hodgson, 1995). Если проблема

доставки чуужеродной ДНК in vitro практически решена, а ее

доставка в клетки-мишени разных тканей in vivo успешно реша-

ется (главным образом, путем создания комбинированных рецеп-

тор-опосредованных конструкций), то другие характеристики

существующих векторной системы - стабильность интеграции,

регулируемая экспрессия, безопасность - все еще нуждаются в

серьёзных доработках. Прежде всего, это касается стабильнос-

ти экспрессии. Последняя может быть достигнута либо при ин-

теграции чужеродной ДНК непосредственно в геном реципиента,

либо путем обеспечения длительной персистенции экзогенной

ДНК в ядре. До настоящего времени интеграция в геном дости-

галась только при использовании ретровирусных либо адено-ас-

социированных векторов (Табл. 9.1). Случайная интеграция

трансфектной ДНК в геном происходит достаточно редко, причем

в случае ретровирусных векторов это происходит только в де-

лящихся клетках. Повысить эффективность стабильной интегра-

ции можно путем совершенствования генных конструкций типа

рецептор-опосредованных систем (Рис. 9.2). Однако, эти век-

торные конструкции должны включать только часть вирусных ге-

нов, например, гены обратной транскриптазы, ретровирусной

интегразы, некоторые транспазоновые гены, парвовирусные

rep-гены (см. 9.4.4). Учитывая возможный мутагенный эффект

случайной интеграции, весьма перспективным представляется

создание достаточно стабильных эписомных векторов. В част-

ности, в последнее время особое внимание уделяется созданию

векторов на базе искусственных хромосом млекопитающих (Mam-

malian Artificial Chromosomes), которые могли бы достататоч-

но автономно находиться в ядре, сохраняя способность к реп-

ликации и экспрессии. Удобными моделями для этого представ-

ляются автономно реплицирующиеся циркулярные микрохромосомы

раковых клеток (Hodgson, 1995).

Особенно привлекательной в плане генной коррекции

представляется возможность замены всего мутантного гена или

его мутировавшей части (например, одного экзона) на нормаль-

ный аналог, что может быть достигнуто путем гомологичной ре-

комбинации. При этом в идеале можно ожидать не только дли-

тельную персистенцию введенного гена, но и сохранение нор-

мальной экспрессии. С этой целью в конструкции, используемые

для переноса ДНК, включают агенты, повышающие частоту гомо-

логичного спаривания, например, бактериальную рекомбина-

зу. Показано, что в этих условиях частота гомологичной ре-

комбинации может превышать 2.5*10-4. Это достаточно для то-

го, чтобы с помощью ПЦР отобрать нужные клоны клеток. Для

направленного введения фрагментов гена в строго определенные

локусы генома недавно разработана система двойной замены,

основанная на использовании HPRT-зависимых эмбриональных

стволовых клеток и векторной конструкции содержащей ген HPRT

(гипоксантин-фосфорибзилтрансферазы) и ген тимидин-киназы

вируса герпеса (HSV). Двойная селекция трансформантов позво-

ляет отобрать клетки, в которых произошла гомологичная ре-

комбинация. Такой подход нашел широкое применение при созда-

нии искусственных моделей наследственных болезней у человека

(см. подробней Главу VIII). Однако, в клинической практике

он еще не используется.

Раздел 9.5 Генотерапия моногенных наследственных забо-

леваний.

Вопросы генотерапии наследственных заболеваний подробно

рассмотрены в многочисленных обзорах (Ledley, 1987; Ander-

son, 1992; Pyeritz, 1993; Breakefield, 1993; Lowenstein,

1994; Kay, Woo, 1994; Brown et al., 1994; Дризе, 1994; Crys-

tal, 1995) и достаточно полно суммированы в недавно опубли-

кованной монографии (Culver, 1994).

Уже через год после первого введения маркерного гена в

организм человека была проведена успешная клеточная сомати-

ческая генотерапия наследственного заболевания, обусловлен-

ного дефицитом аденозиндезаминазы (ADA) (см. 9.1). При этом

заболевании в крови пациентов накапливается в высокой кон-

центрации 2'-дезоксиаденозин, оказывающий токсическое дейс-

твие на T- и B- лимфоциты, в результате чего у больных раз-

вивается серьезный комбинированный иммунодефицит. Для под-

держания жизни пациентов проводят переодические гетерологич-

ные трансплантации клеток костного мозга, однако, лишь для

трети больных могут быть подобраны совместимые доноры. Эн-

зим-замещающая терапия также приводит к заметному улучшению

состояния пациентов, но, как правило, успех этот носит вре-

менный характер. План генной терапии, разработанный сотруд-

никами Национального Института Здоровья США (NIH) и одобрен-

ный RAC, заключался в назначении больным аутологичных лимфо-

цитов, трансдуцированных нормальным ADA-геном. Осуществление

этого плана потребовало выполнения следующих процедур: изо-

ляции клеток из крови пациента; активации и иммуностимуляции

роста T-лимфоцитов в культуре; трансдукции их ретровирусным

вектором, несущим нормальный ADA-ген и маркерный ген neo;

отбора трансдуцированных клеток на селективной среде; внут-

ривенной реинфузии модифицированных T-лимфоцитов пациенту.

Первой пациенткой, подвергшейся этой терапии, была 4-х лет-

няя девочка (см.раздел 9.1). На протяжении 10.5 месяцев ей

было сделано 8 аутологичных вливаний трансдуцированных

T-лимфоцитов и после полугодового перерыва программу реинфу-

зий повторяли каждые 3-5 месяцев. Уже после первого цикла

число T-лимфоцитов нормализовалось, концентрация ADA в цир-

кулирующих клетках крови увеличилась с 1% до 20 - 25% нор-

мального уровня и резко улучшились основные иммунные харак-

теристики. Вопреки многим прогнозам, на протяжении более,

чем 6 месяцев после прекращения массированных вливаний в

кроветоке пациентки устойчиво сохранялось высокое число кор-

ректированных T-клеток, что позволило в дальнейшем снизить

количество вводимых клеток и значительно увеличить промежут-

ки между этими процедурами. Спустя три месяца после первых

клинических испытаний была начата программа генной терапии

ADA-дефицита у второй 9-летней пациентки. После 11 инфузий

трансдуцированных аутологичных T-клеток состояние этой де-

вочки также заметно улучшилось и отмечалась полная нормали-

зация соответствующих биохимических и иммунологических пока-

зателей. Таким образом, необходимо еще раз отметить, что при

лечении обеих пациенток был достигнут очевидный клинический

эффект (Anderson,1992; Culver, 1994).

Однако, в обоих случаях не все иммунные функции восста-

навливались полностью. По-видимому, это было связано с тем,

что коррекция генетического дефекта проводилась в зрелых

T-лимфоцитах. В связи с этим предложены программы генной те-

рапии с помощью реинфузии смешанной популяции трансдуциро-

ванных T-лимфоцитов и перефирических стволовых клеток крови.

Возможность изоляции и трансдукции таких тотипатентных ство-

ловых клеток показана в экспериментах на приматах.

Успех первых клинических испытаний явился мощным стиму-

лом для ускорения развития новых генотерапевтических методов

применительно к другим наследственным заболеваниям. В

Табл. 92 представлен список болезней, для которых принципи-

ально возможен генотерапевтический подход и генокоррекция

наследственного дефекта с большой вероятностью будет осу-

ществлена уже в обозримом будущем, а также те заболевания,

для которых уже имеются официальныо утвержденные протоколы и

которые находятся на разных стадиях клинических испытаний.

Таблица 9.2. Наследственные заболевания, генокоррекция кото-

рых находится на стадии клинических испытаний (КИ), экспери-

ментальных разработок (ЭР) и принципиально возможна (ПВ).

(Сulver, 1994; Lowenstein, 1994)

---T----------------T-----------------------T----------------T----¬

¦ ¦Болезнь ¦ Дефектный ген ¦ Клетки-мишени ¦Ста-¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦дия ¦

+--+----------------+-----------------------+----------------+----+

¦1 ¦Иммунодефицит ¦аденозиндезаминаза ¦лимфоциты ¦ КИ ¦

¦2 ¦Иммунодефицит ¦пуриннуклеозид- ¦лимфоциты ¦ ПВ ¦

¦ ¦ ¦фосфорилаза ¦ ¦ ¦

¦3 ¦Семейная гипер- ¦рецептор липопротеинов ¦гепатоциты ¦ КИ ¦

¦ ¦холистеринемия ¦низкой плотности ¦ ¦ ¦

¦4 ¦Гемофилия В ¦фактор 1Х ¦фибробласты ¦ КИ ¦

¦5 ¦Гемофилия А ¦фактор Y111 ¦миобласты, ¦ ЭР ¦

¦ ¦ ¦ ¦фибробласты ¦ ¦

¦6 ¦Болезнь Гоше ¦в-глюкоцереброзидаза ¦макрофаги, ¦ КИ ¦

¦ ¦(сфинголипидоз) ¦ ¦стволовые клетки¦ ¦

¦7 ¦Болезнь Хантера ¦идуронат-сульфатаза ¦макрофаги, ¦ ПВ ¦

¦ ¦ ¦ ¦стволовые клетки¦ ¦

¦8 ¦Синдром Гурлера ¦L-идуронидаза ¦макрофаги, ¦ ПВ ¦

¦ ¦ ¦ ¦стволовые клетки¦ ¦

¦9 ¦Эмфизема легких ¦альфа-1-антитрипсин ¦лимфоциты ¦ ЭР ¦

¦10¦Муковисцидоз ¦CF-трансмембранный ¦эпителий бронхов¦ КИ ¦

¦ ¦ ¦регулятор ¦ ¦ ¦

¦11¦Фенилкетонурия ¦фенилаланингидроксилаза¦гепатоциты ¦ ЭР ¦

¦12¦Гипераммонемия ¦орнитинтранскарбамилаза¦гепатоциты ¦ ПВ ¦

¦13¦Цитрулинемия ¦аргиносукцинатсинтетаза¦гепатоциты ¦ ПВ ¦

¦14¦Мышечная дист- ¦дистрофин ¦миобласты, ¦ ЭР ¦

¦ ¦рофия Дюшенна ¦ ¦миофибриллы ¦ ¦

¦15¦Талассемия ¦бета-глобин ¦эритробласты ¦ ЭР ¦

¦16¦Серповиднокле- ¦бета-глобин ¦эритробласты ¦ ЭР ¦

¦ ¦точная анемия ¦ ¦ ¦ ¦

¦17¦Респираторный ¦сурфактант ¦эпителий бронхов¦ ЭР ¦

¦ ¦дистресс-синдром¦белок В ¦ ¦ ¦

¦18¦Хронический ¦NADPH-оксидаза ¦гранулоциты ¦ ЭР ¦

¦ ¦грануломатоз ¦ ¦ ¦ ¦

¦19¦Болезнь ¦белок-предшественник ¦нервные клетки ¦ ЭР ¦

¦ ¦Альцгеймера ¦в-амилоида (ААР) ¦ ¦ ¦

¦20¦Болезнь ¦тирозин-гидроксилаза ¦миобласты, ¦ ЭР ¦

¦ ¦Паркинсона ¦ ¦фибробласты ¦ ¦

¦ ¦ ¦ ¦нервные клетки ¦ ¦

¦21¦Метахромати- ¦арилсульфатаза А ¦стволовые клетки¦ ПВ ¦

¦ ¦ческая лейко- ¦ ¦крови, ¦ ¦

¦ ¦дистрофия ¦ ¦нервные клетки ¦ ¦

¦22¦Синдром Леш- ¦гипоксантин-фосфо- ¦нервные клетки ¦ ПВ ¦

¦ ¦Нихана ¦рибозил трансфераза ¦ ¦ ¦

L--+----------------+-----------------------+----------------+-----

Как следует данных Таблицы 9.2, на стадии клинических

испытаний в 1994г. уже находились 5 моногенных заболеваний.

Для 10 генных болезней проводились экспериментальные иссле-

дования и отрабатывались требования, необходимые для получе-

ния официального разрешения клинических испытаний (см.9.1).

Исследования по остальным заболеваниям находятся на началь-

ных этапах. Список таких заболеваний очень быстро увеличива-

ется. Обращает на себя внимание, что первые программы по

генной терапии связаны с модификацией гемопоэтических клеток

(Wivel, Walters, 1993). Клетки крови наиболее доступны для

генетических манипуляций. После изоляции различные типы кле-

ток крови могут быть легко размножены, подвергнуты трансфек-

ции in vitro, а затем возвращены пациенту. Генетической мо-

дификации могут быть подвергнуты не только зрелые клетки

(лимфоциты, макрофаги), но и их предшественники - стволовые

клетки. Важным обстоятельством, в этой связи, является то,

что процедура трансплантации клеток костного мозга уже широ-

ко используется в клинике. Разработаны и достаточно эффек-

тивные методы выделения стволовых гемопоэтических клеток че-

ловека (Berardi etal.,1995). В экспериментах на животных по-

казано, что модифицированные клетки как миелоидного, так и

лимфоидного рядов могут сохраняться в кровотоке на протяже-

нии более двух лет после аутологичной пересадки клеток кост-

ного мозга, трансдуцированных in vitro. Путем трансфекции

клеток крови соответствующими генами можно лечить не только

собственно заболевания крови, но и использовать их для лече-

ния многих других заболеваний как моногенной природы

(Табл. 9.2), так и различных опухолей и инфекций (см.ниже).

Другими достаточно универсальными реципиентами чужерод-

ных генов могут быть фибробласты и мышечные клетки (миоблас-

ты, миофибриллы). Они могут быть использованы для тех забо-

леваний, где необходима коррекция генов, белковые продукты

которых должны поступать в сыворотку крови или дифундировать

в соседние клетки. Особенно удобны для целей генной терапии

скелетные мышцы, в которых благодаря отсутствию эндонуклеаз-

ной активности (см.раздел 9.4.2) принципиально возможен пе-

ренос генов in vivo путем прямой иньекции экзогенной ДНК.

Инъецированная в мышцы ДНК способна экспрессироваться в мио-

фибриллах находясь в неинтегрированном, эксрахромосомном

состоянии. Белковые продукты экспрессии в течение длительно-

го времени после трансдукции будут поступать в кровь. Про-

должительность экспрессии значительно увеличивается, если

генетическую модификацию производят в аутологичных миоблас-

тах, которые после этого инъецируют в зрелую мышцу. Эти осо-

бенности уже позволили начать эксперименты по генной терапии

таких заболеваний как гемофилии А и В, дефицит антитрипсина,

диабет, врожденный дефицит гормона роста и даже болезнь Пар-

кинсона (Culver, 1994; Lowenstein, 1994). Достаточно удобны-

ми для генетических модификаций оказались и фибробласты ко-

жи, в первую очередь, благодаря легкости генноинженерных ма-

нипуляций ex vivo.

Раздел 9.6. Генотерапия ненаследственных заболеваний:

опухоли, инфекции.

Параллельно с развитием исследований в области генокор-

рекции наследственных дефектов успешными также оказались по-

иски методов терапевтического использования смысловых после-

довательностей ДНК для лечения ненаследственных заболеваний

и, главвным образом, злокачественных опухолей и вирусных ин-

фекций. Существенно, что именно в этих разделах патологии

поиски путей генокоррекции проводятся особенно интенсивно, а

число уже одобренных протоколов клинических испытаний во

много раз превышает число таковых для лечения моногенных бо-

лезней (см.Рис. 9.1). Такое положение дел, по-видимому,

прежде всего объясняется широкой распространенностью онколо-

гических заболеваний и отсутствием достаточно эффективной

терапии. В Табл. 9.3 перечислены основные методологические

подходы к генотерапии различных опухолей, разработанные и

широко используемые уже на современном этапе. Многие из этих

подходов вполне приложимы и для борьбы с наиболее серьезными

инфекционными заболеваниями, например, со спидом.

Таблица 9.3. Основные методологические подходы в генокоррек-

ции онкологических заболеваний.

---------------------------------T-----------------------------¬

¦ П Р И Н Ц И П ¦ ВВОДИМЫЕ ГЕНЫ ¦

+--------------------------------+-----------------------------+

¦1. Повышение иммунореактивности ¦ гены чужеродных ¦

¦ опухоли ¦ антигенов, цитокинов ¦

¦2. Генетическая модификация ¦ гены цитокинов, ¦

¦ иммунных клеток ¦ ко-стимуляторов ¦

¦3. Инсерция генов "чувствитель- ¦ гены тимидин-киназы HSV, ¦

¦ ности" либо генов "самоубийц"¦ цитозин дезаминазы ¦

¦4. Блок экспрессии онкогенов ¦ антисмысловые Ki-ras мРНК, ¦

¦ ¦ гены внутриклеточных антител¦

¦5. Инсерция генов-супрессоров ¦ р53 ¦

¦ опухолей ¦ ¦

¦6. Защита нормальных клеток от ¦ гены лекарственной ¦

¦ химеотерапии. ¦ устойчивости тип 1. ¦

¦7. Индукция синтеза противоопухо¦ гены интерлейкина-2, ¦

¦ левых в-в нормальными клеткам¦ интерферона ¦

¦8. Продукция противопухолевых ¦ вакцины типа БЦЖ, экспресси-¦

¦ рекомбинантных вакцин. ¦ рующей опухолевой антиген ¦

¦9. Локальная радиопротекция нор-¦ гены трансферазы, ¦

¦ мальных тканей с помощью ¦ глутатион синтетазы ¦

¦ антиоксидантов. ¦ ¦

L--------------------------------+------------------------------

Подробный анализ используемых при этом подходов и ре-

зультаты первых клинических испытаний выходит за рамки наше-

го изложения. Однако, материал этот настолько интересный и

многообещающий, что мы позволим себе на нескольких примерах

охарактеризовать основные принципы построения таких геноте-

рапевтических программ.

Как упоминалось ранее (см. 9.1), перенос гена в орга-

низм человека был осуществлен в 1989 году в большей степени

в исследовательских, а не в терапевтических целях. Это был

маркерный прокариотический ген neo, сообщающий клеткам ус-

тойчивость к неомицину. Он был введен пациенту, страдающему

злокачественной меланомой, в составе трансдуцированных

TIL-клеток (Т -лимфоцитов, полученных из опухолевых тканей

больного). В 1986г. вскоре после идентификации этого нового

класса иммунных клеток, была предпринята попытка лечения ме-

ланомы путем аутологичной внутривенной инфузии TIL-клеток,

предварительно выделенных из опухолей пациентов и интенсивно

наращиваемых in vitro в присутствии ростового фактора IL-2.

Примерно у трети пациентов лечение оказалось эффективным,

хотя в последующем наблюдали значительное число рецидивов

заболевания. Для анализа причин терапевтического эффекта TIL

-клеток и совершенствования методики лечения меланомы необ-

ходимо было исследовать устойчивость вводимых T-лимфоцитов и

их миграцию в организме больного. С этой целью была произве-

дена маркировка используемых для лечения TIL-клеток путем их

трансдукции в культуре ретровирусным вектором, несущим ген

neo, с последующим отбором неомицин-устойчивых клонов и вы-

ращиванием их на среде G418. Результаты исследований показа-

ли, что реинфузированные G418-устойчивые TIL-клетки действи-

тельно проникают в опухоль и могут быть обнаружены там в не-

большом количестве даже спустя 9 недель после введения. Най-

дены отличия субпопуляции T-лимфоцитов в опухоли от общей

популяции инфузированных TIL-клеток.

После успешного испытания переноса маркерного гена neo

в опухолевые ткани путем аутологичной реинфузии трансфециро-

ванных T-лимфоцитов лечение меланомы было дополнена введени-

ем в вектор мышиного гена, контролирующего продукцию, так

называемого фактора некроза опухоли - TNF. Предолагалось,

что локальная секреция этого токсичного для клеток белка в

опухолевых тканях будет способствовать формированию иммунно-

го ответа. Опасность данной терапевтической процедуры обус-

ловлена возможностью разрушения TIL-клеток в печени, мозге и

легких. Поэтому экспрессия TNF-гена под гетерологичным про-

мотором может оказать сильный токсический эффект в этих ор-

ганах. Первые клинические испытания описанной схемы лечения

начаты в январе 1991 года в Национальном Институте Здоровья

(NIH) США.

Другая программа генной терапии, предложенная для лече-

ния меланом, основана на стимуляции противоопухолевого имму-

нитета, опосредованного T-лимфоцитами. Для этого в изолиро-

ванные опухолевые клетки пациента вводят TNF- или IL2-ген

или какие-либо другие гены, секретирующие цитокины, и затем

проводят иммунизацию пациента путем подкожного введения

трансдуцированных клеток. Эта процедура сама по себе может

привести к рассасыванию первичной опухоли или может быть ис-

пользована для изоляции более эффективных TIL-клеток из лим-

фоузлов, вблизи от места инъекции. Подобная иммунизация мо-

жет быть рекомендована для предотвращения рецедивов у паци-

ентов, подвергавшихся другим курсам противоопухолевой тера-

пии. Первая попытка прямого переноса гена в опухолевые клет-

ки пациента без их предварительной изоляции также была

предпринята с целью формирования иммунного ответа против

злокачественной меланомы. Процедура включала прямую иньекцию

в опухоль липосом-плазмидного комплекса с геном, контролиру-

ющим отсутствующий у пациента антиген гистосовместимости

HLA-B7. Другой тип модификации опухолевых клеток основан на

введении в них гена тимидинкиназы Герпеса. Использованный в

работе ретровирусный вектор обеспечивал включение генной

конструкции только в активно пролифирирующие клетки, каковы-

ми и являются клетки опухоли. Впервые эта схема была апроби-

рована при лечении карциномы яичника. После интраперитоне-

альной аутологичной иньекции трансдуцированных клеток злока-

чественной карциномы пациентам назначали противогерпесный

препарат - ганцикловир, избирательно убивающий клетки, экс-

прессирующие ген вирусной тимидин-киназы. Противоопухолевый

эффект был обусловлен летальным действием токсина, образую-

щегося в модифицированных клетках и последующей иммунной ре-

акцией организма на опухолевые клетки.

Подходы, используемые для лечения вирусных инфекций пу-

тем введения в организм человека специфических нуклеиновых

кислот, очень разнообразны и основаны на детальном исследо-

вании молекулярных механизмов взаимодействия инфецирующих

агентов с клетками-хозяина. Мы лишь коротко перечислим ос-

новные принципы, используемые при разработке соответствующих

медицинских протоколов. Наибольшее количество противовирус-

ных программ генной терапии предложено в рамках борьбы со

спидом, хотя аналогичные методы разрабатываются для лечения

гепатита, цитомегаловирусных, герпесных и иных вирусных ин-

фекций. Одна из первых таких программ была направлена на

разрушение регуляторных механизмов репликации вируса иммуно-

дефицита - HIV, путем введения в T-лимфоциты от 20 до 50 ко-

пий TAR-гена, кодирующего активирующий элемент, критический

для переключения генетической программы клетки на вирусную

репликацию. Другая программа включала введение в T-лимфоциты

гена CD4 вирусного антигена для специфического связывания

HIV и выведения его в русло крови. Ряд программ основаны на

введении в T-клетки условно летальных генов, таких как ген

вирусной тимидинкиназы, с тем, чтобы предотвратить нежела-

тельные побочные эффекты в случае неконтролируемого размно-

жения этих клеток или слишком сильного их действия на

HIV-инфецированные клетки. Одним из направлений повышения

эффективности терапевтического использования T-лимфоцитов

для лечения спида является направленная модификация ex vivo

генов главного комплекса гистосовместимости и конструирова-

ние на этой основе "универсальных донорских" клеток. Так,

лишенные HLA-маркеров гетерологичные модифицированные

T-клетки могут быть трансплантированы пациентам без опасения

иммунологической несовместимости. Подобный подход может ока-

заться эффективным при необходимости гетерологичной транс-

плантации в терапевтических целях любых типов клеток. Прин-

ципиально иным способом борьбы с вирусными инфекциями явля-

ется введение в пораженные ткани антисмысловых последова-

тельностей, способных гибридизоваться с вирусами и, таким

образом, их нейтрализовывать (Cohen, Hogan, 1994; Wagner,

1994). Адресность доставки таких последовательностей может

быть достигнута путем их комплексирования с соответствующими

белковыми лигандами (см. 9.4.2).

Раздел 9.7. Некоторые этические и социальные проблемы

генной терапии.

Появление принципиально новых технологий, позволяющих

активно манипулировать с генами и их фрагментами, обеспечи-

вающими адресную доставку новых блоков генетической информа-

ции в заданные участки генома, совершило революцию в биоло-

гии и медицине. Как следует из вышеизложенного, сам ген все

чаще начинает выступать в качестве лекарства, применяемого

для лечения не только моногенных, но и многих других, в том

числе и значительно более распространенных недугов (опухоли,

инфекции). Не за горами применение генотерапии и для борьбы

с мультифакториальными заболеваниями (сердечно-сосудистые,

психические, эндокринологические и многие другие). Уже сей-

час, на современном уровне наших знаний о геноме человека

теоретически вполне возмножны такие его модификации путем

генной трансфекции, которые могут быть предприняты с целью

улучшения ряда физических (например, рост), психических и

интеллекуальных параметров. Таким образом, современная наука

о человека на своем новом витке развития вернулась к идее

"улучшения человеческой породы", когда-то постулированной

выдающимся английским генетиком Фрэнсисом Гальтоном и разви-

той его учениками и последователями (Карл Пирсон, Лионель

Пенроуз, Дж.Халдэйн и мн.др.). Дальнейший ход истории, как

известно, полностью дискредитировал саму идею "улучшения"

человеческой породы. Однако, грядущее "всевластие" человека

над собственным геномом заставляет вновь и вновь возвращать-

ся к этой теме, делают ее предметом постоянных оживленных

дискуссий в широкой и научной печати (Ledley, 1987; Ander-

son, 1992; Wivel, Walters, 1993; Culver,1994). Развернувшая-

ся в этой связи дискуссия позволяет подвести некоторые итоги

и сделать определенные прогнозы.

Уже сейчас не вызывает сомнения, что первоначальные

опасения, связанные с генной инженерией вообще и генной ин-

женерией человека в частности были неоправданны. После мно-

голетней дискуссии и всестороннего рассмотрения на разных

уровнях было признанным целесообразным применение генной те-

рапии для лечения многих заболеваний. Единственным и непре-

менным ограничением, сохраняющим свою силу и в современных

условиях, является то, что все генотерапевтические мероприя-

тия должны быть направлены только на конкретного больного и

касаться исключительно его соматических клеток.

По глубокому убеждению основных авторитетов генной те-

рапии (Фр.Андерсон, Т.Каски, Фр.Коллинс, Дж.Вильсон и

мн.др.), а также согласно существующим регламентациям соот-

ветствующих "разрешительных" комитетов по генно-инженерным

исследованиям (см. 9.1) современный уровень наших знаний не

позволяет проводить коррекцию генных дефектов на уровне по-

ловых клеток и клеток ранних доимплантационных зародышей че-

ловека. Причина этого - реальная опасность засорения гено-

фонда нежелательными искусственными генными конструкциями

или внесение мутаций с непредсказуемыми последствиями для

будущего человечества.

Вместе с тем, по мере совершенствования методов генной

терапии, появления новых технологий, связанных с созданием

более эффективных и безопасных векторных систем и более со-

вершенных генетических конструкций, стремительным ростом объ-

ема информации о структуре генома, картировании новых генов в

научной литературе все чаще и все настойчивее раздаются при-

зывы к возобновлению дискуссии о целесообразности генокоррек-

ции зародышевых и половых клеток человека (Wivel, Walters,

1993; Latchman, 1994).

Основным аргументом в пользу таких вмешательств являет-

ся тот вполне очевидный факт, что по мере того как все боль-

шее число наследственных заболеваний будет доступно эффек-

тивной генной терапии, все большее число особей, гомозигот-

ных по летальным мутантным генам, будет накапливаться в по-

пуляции. Соответственно, тем реальней будут ситуации, когда

оба супруга окажутся гомозиготными носителями мутантного ге-

на. В этом случае получение здорового потомства потребует

генетического вмешательства уже на ранних стадиях и, возмож-

но, будет вполне безопасной и реальной трансфекция гамет или

ранних зародышей.

Эксперименты на животных по созданию искусственных био-

логических моделей наследственных болезней (см.Главу VIII ),

а также первые клинические испытания по доимплантационной

диагностике генных болезней (Verlinsky, Kuliev, 1993; см.

Главу VI) убеждают в том, что такой генно-терапевтический

подход может быть реальным уже в ближайшем будущем. Вполне

естественно, что целесообразность его применения должна оп-

ределяться не только генно-инженерными возможностями, но и

его социальной значимостью и необходимостью. Вот только не-

которые вопросы, которые должны быть решены в рамках предла-

гаемой генетиками широкой дискуссии:

Сможет ли в будущем генная терапия обеспечить столь

полноценную генокоррекцию, которая не представит угрозы для

потомства?

В какой мере полезность и необходимость генотерапевти-

ческой процедуры для одной супружеской четы перевесят риск

такого вмешательства для всего человечества?

Сколь оправданы будут эти процедуры на фоне грядущего

перенаселения планеты ?

Как будут соотноситься генно-инженерные мероприятия на

человеке с проблемами гомеостаза общества и биосферы?

Таким образом, генетическая революция апофиозом которой

явилась генотерапия не только предлагает реальные пути лече-

ния тяжелых наследственных и ненаследственных недугов, но и

в своем стремительном развитии ставит перед обществом новые

проблемы, решение которых необходимо уже в ближайшем обозри-

мом будущем.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14